猶如大力水手愛吃菠菜，這款CAR－T要“吃”四環(huán)素才工作——

CAR－T是一種出現(xiàn)了很多年，但近幾年才得以臨床應用的新型細胞療法。日前，《分子科學》登載了我國科學家對于CAR－T安全性的研究工作：上海海洋大學國際海洋生物科學研究中心、比昂生物等多個單位合作，運用我國擁有自主專利的慢病毒載體技術(shù)，將“四環(huán)素調(diào)控”的基因開關整合到時下最廣泛使用的白血病治療手段CAR－T中，實現(xiàn)了對CAR－T細胞的控制，只有當CAR－T感受到四環(huán)素這一特定化合物的存在時，才會啟動“格斗”模式，勤懇殺敵，而一旦有指標表明T細胞有“殺紅眼”的跡象，只需停止四環(huán)素的供應，CAR－T格斗士就會缺乏能量宕機，防止對機體的“自殺式”損傷。

T細胞“火力全開”，伴隨可怕“風暴”

免疫療法的出現(xiàn)，使得人體內(nèi)免疫系統(tǒng)被“爭取”過來，通過對T細胞加裝體外基因元器件或重啟免疫殺伐功能，形成對抗腫瘤的“生力軍”。目前，治療白血病有效率最高的方法為CAR－T療法，是通過將T細胞導出，在體外裝上有“導航”“偵測”作用的CAR（嵌合抗原受體），再回輸體內(nèi)對付癌細胞，但T細胞的進攻“火力”會由于人工的干預，而不受體內(nèi)調(diào)控機制的控制，“失控”的情況下很可能造成嚴重的細胞因子釋放綜合征（CRS）。

“CRS被業(yè)界形象地稱為‘細胞因子風暴’。”論文通訊作者、上海海洋大學特聘教授楊光華解釋，細胞因子風暴是由T細胞、巨噬細胞和腫瘤細胞之間的相互作用引起的。由于“重裝戰(zhàn)士”T細胞有導航和偵測系統(tǒng)，它能夠敏銳地感受到腫瘤細胞的存在，細胞內(nèi)通路進而被激發(fā)，釋放大量的細胞因子，這些細胞因子正是免疫細胞殺伐腫瘤細胞、能夠使其凋亡的“重要火力”。

“細胞因子引發(fā)的風暴是CAR－T治療中不可回避的�！睏罟馊A說，它不但是治療中的副作用，也是治療腫瘤的臨床表現(xiàn)。

美國女孩艾米麗（Emily）是首位CAR－T治愈的白血病患兒，她有著可怕的“風暴”經(jīng)歷。據(jù)記載，在細胞注射到體內(nèi)后，艾米麗迅速發(fā)燒，血壓驟降，重度昏迷，在重癥監(jiān)護室里靠呼吸機熬過了兩周。當時醫(yī)生們已經(jīng)覺得她不可能活下來了。檢測報告顯示，她體內(nèi)的IL－6蛋白激增，這表明她的免疫系統(tǒng)正在不斷攻擊自身。隨后，醫(yī)生決定給她使用一種免疫抑制藥物阻止這種自身攻擊。用藥后幾小時內(nèi)，艾米麗的情況立即變好，進一步檢測結(jié)果顯示，她體內(nèi)的癌細胞消失了。

可見，CAR－T誘發(fā)“風暴”不可避免。但由于CAR－T擁有80％—90％的高治愈率，使得盡管這種療法相當危險，去年仍被美國食品和藥物管理局（FDA）批準可用于臨床，并于今年4月被批準進入美國醫(yī)保。

如何讓擁有高治愈率的CAR－T告別高風險？學界進行了大量的研究，并提出多種技術(shù)路線，例如施用免疫抑制藥物、植入誘導型自殺基因系統(tǒng)、嚴重情況需采用激素處理等，但目前“風暴”并發(fā)癥仍是其成為標準醫(yī)療護理的障礙。業(yè)內(nèi)普遍認為，CAR－T應用的難點并不集中在前期的細胞治療，而在于后期的副作用處理及質(zhì)量控制。

“抑制劑的‘補救’很難掌握主動權(quán)�！睏罟馊A表示，通過基因元件的“供能”控制將更具有主動權(quán)，也有更多地可操作性。

變病毒為友軍，給T細胞加個“遙控器”

“CAR－T技術(shù)專利幾乎被美國涵蓋。”楊光華說。實際上，美國醫(yī)療領域仍在不斷探索新機制，例如今年4月《自然》報道，紀念斯�。瓌P特琳癌癥中心（MSK）發(fā)現(xiàn)預防“風暴”的新細胞理論以及新抑制劑并已經(jīng)申請專利。

“我們不能跟著別人的思路對‘風暴’進行控制，那到應用時會遇到‘專利門檻’�！睏罟馊A說，為此，他帶領團隊從2009年開始從另一個角度入手，試圖給T細胞加個“遙控器”，增加CAR－T技術(shù)中人們對T細胞的控制力。

“慢病毒載體是人們進行基因工程操作的一個有效工具�！睏罟馊A說，慢病毒載體和病毒一樣能夠“侵入”細胞，但并不具有毒性，能把目標片段插入目標細胞中，從而實現(xiàn)基因的改造。

要把病毒“馴化”成友軍并不容易，臨床要求嚴格，并且大規(guī)模生產(chǎn)和純化非常困難。楊光華團隊試圖通過慢病毒載體對CAR－T進行改良，并使其實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，同時依托該技術(shù)成立了上海比昂生物醫(yī)藥科技有限公司。“不同于常見的化學合成藥物，基因藥物的大規(guī)模生產(chǎn)與純化非常困難。目前在基因載體大規(guī)模生產(chǎn)上，比昂生物的純化率已經(jīng)比國際同行的高10倍�！睏罟馊A說，慢病毒載體的生產(chǎn)包含了質(zhì)粒獲取、細胞轉(zhuǎn)染、病毒收集與純化等一系列復雜的步驟，每一個步驟都會影響最后獲得的載體活性，因此需要在工藝上不斷優(yōu)化，才能得到高質(zhì)量的載體。

在轉(zhuǎn)導過程中，團隊對載體用量、轉(zhuǎn)導條件、T細胞培養(yǎng)、增強劑的使用等關鍵條件進行了探索與優(yōu)化，最后取得成功�！八�有的技術(shù)都已申請了專利。核心發(fā)明專利已經(jīng)由國際專利體系PCT授權(quán)�！睏罟馊A說，“我們同時具有病毒類載體大規(guī)模生產(chǎn)工藝專利技術(shù)，可滿足國內(nèi)外制藥公司、醫(yī)院等對CAR－T可誘導慢病毒的需要，用于Ⅰ期和Ⅱ期的臨床實驗�！�

體外實驗證明，“四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)”高效

“開關系統(tǒng)通過基因合成、酶切連接等分子生物學技術(shù)，我們將‘四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)’與CD19－CAR結(jié)構(gòu)一起整合進慢病毒載體中�！睏罟馊A說，這樣在對T細胞進行CAR改造的同時，“四環(huán)素遙控器”也就同步裝配了。

服用四環(huán)素后，進入人體的CAR－T就開始發(fā)揮作用；停止服藥后，CAR－T將不再表達，而且能通過藥物劑量來控制CAR－T療效的強弱。這樣帶來的好處是當患者出現(xiàn)難以承受的不良反應時，停止服用四環(huán)素就可以讓患者體內(nèi)發(fā)揮作用的CAR－T停下來，當患者耐受性逐漸轉(zhuǎn)好之后，又可以通過服藥繼續(xù)開始治療。在間隔期間，B細胞可以恢復，增強抗癌效果。

“臨床前的基本研究，取得了效果非常好的數(shù)據(jù)�！睏罟馊A說，在此次研究中，他們通過將“四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)”結(jié)合到CD19－CAR構(gòu)建物中，開發(fā)出新的誘導性細胞iCAR19 T。

試驗數(shù)據(jù)表明，新的iCAR19 T細胞增殖、細胞因子產(chǎn)生、CAR表達、CD19特異性細胞毒性強。用四環(huán)素衍生物誘導48小時后，誘導細胞的相對CAR表達量是未誘導細胞的5倍，說明四環(huán)素的施用能激發(fā)“四環(huán)素戰(zhàn)士”的戰(zhàn)斗力。此外，經(jīng)四環(huán)素衍生物處理的細胞對靶細胞有非常顯著的高特異性裂解。這些結(jié)果表明植入系統(tǒng)成功地控制了iCAR19 T細胞的活性�！拔覀儗�T細胞的控制力越強，臨床安全性將越強。”楊光華說，新的細胞同時保持了強大的抗腫瘤作用。

“這項技術(shù)在實際應用于人體之前還需要經(jīng)過動物實驗、臨床試驗等多個步驟驗證其安全性和有效性。我們正在針對實際使用過程中可能遇到的問題，對這一技術(shù)做進一步優(yōu)化調(diào)整，以盡快開展體內(nèi)的實驗驗證。”楊光華說，團隊的目標是臨床應用，因此在實驗階段就遵循GMP生產(chǎn)標準，所有的制造工藝和隨后的檢測都在GMP設施中進行，基因載體的質(zhì)量控制也嚴格遵循FDA的指導原則。