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文章背景簡介

BACKGROUND INTRODUCTION

褐藻膠是海帶等褐藻細胞壁的主要成分，它是一種由β－D－甘露糖醛酸（M）及α－L－古爾糖醛酸（G）組成的線性多糖。它由三種不同的單元組成，即聚β－d－甘露糖醛酸（polyM）、聚α－l－古龍?zhí)侨┧幔╬olyG）和雜聚物（polyMG）。海藻酸鈉具有良好的化學性質(zhì)和多種活性，且來源豐富、成本低廉，在食品和醫(yī)藥工業(yè)中得到了廣泛的應用。但由于分子量大、生物利用度低，褐藻酸鹽的應用受到很大限制。近年來，褐藻膠的降解產(chǎn)物褐藻寡糖由于具有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤的生物活性和良好的溶解性，受到越來越多的關注。

褐藻膠裂解酶是廣泛存在于海洋微生物、土壤微生物、噬菌體、病毒及海洋軟體動物體內(nèi)的一種可通過β－消除作用將褐藻膠降解為不飽和寡糖的酶類。根據(jù)蛋白質(zhì)序列相似性，褐藻膠裂解酶被分在PL－5、6、7、14、15、17和18家族。根據(jù)其底物特性，海藻酸鈉裂合酶可分為G區(qū)特異性裂合酶（polyG裂解酶）和M區(qū)特異性裂合酶（polyM裂解酶）。而根據(jù)作用方式，則可分為內(nèi)溶型和外溶型。內(nèi)溶型可以識別并裂解糖苷鍵將褐藻膠分解成二糖、三糖、四糖等不飽和低聚糖，而外溶型則可以進一步將低聚糖降解為單體。

2019年，南京工業(yè)大學Zhu B等人在《Biotechnology for Biofuels》（IF＝5．497，工程技術(shù)1區(qū)）上發(fā)表了題為“Elucidation of degrading pattern and substrate recognition of a novel bifunctional alginate lyase from Flammeovirga sp． NJ－04 and its use for preparation alginate oligosaccharides”的文章。Flammeovirga sp．NJ－04是一種從深海中分離出的可以降解褐藻酸鹽的菌株，研究已發(fā)現(xiàn)其中含有可以降解褐藻酸鹽的基因簇。該研究從這一菌株中克隆鑒定了一種新的PL7家族雙功能褐藻膠裂解酶FsAlgB。與PL7家族的大多數(shù)褐藻膠裂解酶一樣，它能以內(nèi)溶方式將褐藻酸降解為低聚糖。據(jù)報道，PL7家族中鞘氨醇單胞菌的A1－II′表現(xiàn)為β－夾心果凍卷折疊（β－sandwich jelly roll－fold）結(jié)構(gòu)，它可以與四糖底物結(jié)合水解成二糖和三糖。與四糖結(jié)合的A1－II′結(jié)構(gòu)表明，Gln189和Arg146是底物羧基的中和劑，此外還有作為廣義堿的His191以及作為廣義酸的Tyr284。然而，目前PL7家族酶的底物降解模式尚不清楚。本文對FsAlgB的降解方式、生化特性、作用方式及產(chǎn)物特征進行了分析研究。

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所用到的主要方法

METHODS

1．質(zhì)粒構(gòu)建及表達

2．HiTrapTM脫鹽

3．SDS－PAGE

4．紫外吸收法測酶活

5．ESI－MS

6．TLC薄層色譜

7．分子模型及對接分析

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文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

背景：褐藻寡糖是一種具有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤等多種生理功能的低聚糖，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和食品工業(yè)中得到廣泛應用。雙功能海藻酸裂合酶能更有效地將褐藻酸多糖降解為褐藻寡糖。因此，尋找新的雙功能褐藻酸裂合酶是生產(chǎn)褐藻寡糖的關鍵。

結(jié)果：本文從深海細菌Flammeovirga sp．NJ－04中克隆并鑒定出了一種新的雙功能褐藻酸裂合酶FsAlgB，其在pH8．0和40℃下具有廣泛的底物特異性及高活性（1760．8U／mg）。并且，F(xiàn)sAlgB對polyG（0．69mM）和polyMG（0．92mM）的Km值低于對海藻酸鈉（1．28mM）和polym（2．06mM）的Km值。重組表達FsAlgB后，進一步鑒定其為一種內(nèi)溶性褐藻膠裂解酶，它可以識別的最小底物為四糖，并能裂解其？3到＋1亞基之間的糖苷鍵。

結(jié)論：本研究為具有廣泛底物特異性的海藻酸鈉裂合酶的底物識別和降解模式提供了更深入的見解。

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