應(yīng)用氧化還原平衡工程提高釀酒酵母L-乳酸產(chǎn)量
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01
文章背景簡介
BACKGROUND INTRODUCTION
聚乳酸是一種可再生的原材料,越來越多地用于生物塑料的制造,它提供了一種可持續(xù)的替代石油的材料。最近關(guān)注的焦點集中在合成聚乳酸的L-乳酸單體的生產(chǎn)上。L-乳酸通常由乳酸菌在碳水化合物發(fā)酵中大量產(chǎn)生,由于這些微生物對pH較敏感,工業(yè)乳酸生產(chǎn)需要添加大量的中和劑,如CaCO3、NaOH和NH4OH,這些中和劑損害了乳酸鹽沉淀的再生,并且增加了成本,因此限制了乳酸的生產(chǎn)。
丙酮酸脫羧酶(PDC1,PDC5和PDC6)編碼基因的缺失以及異源NAD+依賴性乳酸脫氫酶的表達,會導(dǎo)致釀酒酵母菌株能夠在很少或沒有乙醇形成的情況下產(chǎn)生乳酸。雖然這確實使乙醇減少甚至消失,但乳酸產(chǎn)量并沒有很大的提高。
代謝過程中,氧化還原輔因子在耦合分解代謝和合成代謝以及能量產(chǎn)生中起著關(guān)鍵作用。細胞中的氧化還原輔因子是動態(tài)消耗的,且由許多同時發(fā)生的氧化還原反應(yīng)補充。因此,氧化還原輔助因子的擾動影響產(chǎn)品概況和細胞內(nèi)代謝物水平。事實上,通過靶向氧化還原輔因子(如NADH)來進行工程代謝是釀酒酵母中的一種有效策略。
2015年,三星先進技術(shù)研究所生物材料實驗室的Gyeonggi-do等人在《Biotechnol. Bioeng.》(IF=4.260,工程技術(shù)2區(qū))發(fā)表了題為“Engineering cellular redox balance in Saccharomyces cerevisiae for improved production of L-lactic acid”的文章。在這項研究中,通過刪除胞質(zhì)NADH脫氫酶(NDE1和Nde2)的NADH消耗反應(yīng)來操縱細胞內(nèi)氧化還原輔助因子,可以有效提高釀酒酵母的L-乳酸產(chǎn)量。
02
所用到的主要方法
METHODS
1.質(zhì)粒的構(gòu)建
2.不同強度的啟動子的選擇
3.L-乳酸產(chǎn)生菌的構(gòu)建
4.搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸
5.補料分批發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸
03
文章主要內(nèi)容摘要
ABSTRACT
釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)是最具特征的真核生物,是最大工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)品生產(chǎn)的首選微生物細胞工廠,并且作為各種化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)強大的、商業(yè)性的、可兼容的工具而被開發(fā)利用。釀酒酵母也被用作乳酸生產(chǎn)的宿主,因其具有很高的耐酸性。本研究通過將細胞代謝通量重定向到L-乳酸的產(chǎn)生,構(gòu)建了L-乳酸高產(chǎn)釀酒酵母(S.cerevisiae)。為此,本研究刪除了編碼丙酮酸脫羧酶1(PDC1)、L-乳酸細胞色素c氧化還原酶(CYB2)和甘油-3-磷酸脫氫酶(GPD1)的釀酒酵母基因,代之以異源L-乳酸脫氫酶(LDH)基因。編碼外源性NADH脫氫酶同工酶的兩個新的靶基因(NDE1和NDE2)也從基因組中刪除,以重新設(shè)計細胞內(nèi)氧化還原平衡。結(jié)果發(fā)現(xiàn),構(gòu)建的菌株產(chǎn)生乳酸的效率更高(最終L-乳酸滴度增加了32.6%)。當(dāng)在生物反應(yīng)器中以飼料批式模式進行測試時,該工程菌在低pH條件下產(chǎn)生117g/L的L-乳酸。這一結(jié)果表明,應(yīng)用氧化還原平衡工程應(yīng)與代謝工程相結(jié)合的技術(shù),可以有效構(gòu)建L-乳酸高產(chǎn)釀酒酵母。
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在釀酒酵母中同步敲除多基因的CRISPR-Cas系統(tǒng)
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