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液體PTVA:一種在畢赤酵母中生成多拷貝克隆的高效、低成本新方法

01

文章背景簡(jiǎn)介

BACKGROUND INTRODUCTION

畢赤酵母常用于表達(dá)外源蛋白,是一個(gè)理想的細(xì)胞工廠,因?yàn)樗軌蜻_(dá)到非常高的細(xì)胞密度,并將蛋白質(zhì)分泌到上清液中,并且畢赤酵母本身分泌的天然蛋白質(zhì)較少,簡(jiǎn)化了下游純化的工藝。增加同源基因的拷貝數(shù)量可以使外源蛋白的產(chǎn)量增加。然而,由于蛋白在分泌途徑中會(huì)達(dá)到飽和,多拷貝克隆和外源蛋白表達(dá)兩者之間的關(guān)系并不是線性的。因此,研究中需要測(cè)定具有不同拷貝數(shù)的菌株,以確定蛋白表達(dá)量最大的菌株。因此,需要一種快速、簡(jiǎn)便的方法來產(chǎn)生具有一定基因拷貝數(shù)的菌株。

目前,產(chǎn)生多拷貝克隆的實(shí)驗(yàn)方法有幾種,包括轉(zhuǎn)化前載體的體外多克隆、利用高濃度抗生素直接篩選轉(zhuǎn)化子等。采用直接選擇法,在含有較高濃度抗生素的平板上產(chǎn)生的菌落數(shù)量往往大大減少,從而會(huì)限制獲得的多拷貝菌株的數(shù)量。由于直接選擇法生成多拷貝克隆的效率較低,2008年Sunga等人提出了轉(zhuǎn)化后矢量放大的方法(PTVA)。在PTVA中,細(xì)胞不是在平板上直接使用高濃度的抗生素來篩選,而是隨著抗生素濃度的增加來進(jìn)行篩選,隨著細(xì)胞抗生素耐藥基因的拷貝數(shù)增加,使細(xì)胞適應(yīng)更高的抗生素濃度。

PTVA已被廣泛應(yīng)用于畢赤酵母,然而,盡管PTVA比較容易操作,但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。2016年2月5日,倫敦帝國(guó)學(xué)院(Imperial College London)的Rochelle Aw 和Karen M. Polizzi等人,在《Microbial Cell Factories》雜志(當(dāng)前IF4.402;工程技術(shù)2區(qū))發(fā)表了題為“Liquid PTVA: a faster and cheaper alternative for generating multi-copy clones in Pichia pastoris”的文章,描述了一種通過在液體介質(zhì)中連續(xù)傳遞來減少PTVA時(shí)間和成本的方法,這種方法能夠很好的獲得包含不同拷貝數(shù)的菌株。

02

所用到的主要方法

METHODS

1.轉(zhuǎn)換后矢量放大技術(shù)(PTVA)

轉(zhuǎn)換后矢量放大技術(shù)(PTVA)是指細(xì)胞不是直接通過高濃度的抗生素來進(jìn)行篩選,而是隨著抗生素濃度的增加來篩選多拷貝的一種方法。在篩選的初級(jí)階段,抗生素耐藥基因的拷貝數(shù)增加,使細(xì)胞適應(yīng)更高的抗生素濃度。因此,在較高的抗生素濃度下存活的菌株也含有較高數(shù)量目的基因的完整副本。

2.Q-PCR

3.分光光度法

4.載體構(gòu)建

03

文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

背景:為了提高畢赤酵母重組蛋白表達(dá)的產(chǎn)量,研究人員經(jīng)常使用多個(gè)同源基因拷貝克隆的方法。轉(zhuǎn)化后矢量放大技術(shù)(PTVA)可以有效地在畢赤酵母中生成多拷貝克隆。然而,盡管這種方法相對(duì)容易操作、成功率較高,但是這個(gè)過程時(shí)間周期比較長(zhǎng),與此同時(shí)也會(huì)花費(fèi)較多的金錢。

結(jié)果:本文開發(fā)了一種改良版的PTVA,稱為液體PTVA,這種方法克服了傳統(tǒng)PTVA(在固體培養(yǎng)皿篩選)的缺點(diǎn),能夠更快、更便宜地選擇多拷貝克隆。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞是在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的,只是最后的篩選是在瓊脂平板上進(jìn)行的。這種方法不僅減少了抗生素總體的使用情況,而且提高了克隆擴(kuò)增的速度。此外,該研究還發(fā)現(xiàn):以單一拷貝的菌株來進(jìn)行篩選可使兩種PTVA(傳統(tǒng)平板篩選和液體篩選)產(chǎn)生更高的拷貝數(shù)菌株。另外,在液體PTVA中使用Zeocin作為篩選抗生素,可以獲得生長(zhǎng)速度較高的菌株。

結(jié)論:本文創(chuàng)建了一種多拷貝克隆方法——液體PTVA,這種方法可以在12天內(nèi)完成,而不是傳統(tǒng)的45天,而且花費(fèi)的成本大約只有先前方法的一半。

相關(guān)鏈接

一種新型無標(biāo)記、多拷貝畢赤酵母過表達(dá)載體的構(gòu)建與應(yīng)用

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