華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)部分報告：《今幸膠囊對小鼠 H22 肝癌的免疫調(diào)控作用》

1  材料與方法

1.1   樣品

今幸膠囊由浙江亞克藥業(yè)有限公司提供（樣品批號：170601），內(nèi)容物為類白色顆粒，感官檢查未見異常。

1.2  實(shí)驗(yàn)動物

C57BL/6J 雄性小鼠，6 周齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院無特定病原體（SPF）級實(shí)驗(yàn)動物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞

小鼠肝癌細(xì)胞系 H22 購自 ATCC 細(xì)胞庫。

1.4  主要藥品、試劑

胸腺五肽（thymopentin，TP-5）、順鉑（cis-platinum，CDDP）、RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（青霉素、鏈霉素）、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、刀 豆 球 蛋 白 A （ Concanavalin A ， ConA ） 、 噻 唑 蘭 （ Methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）、APC 標(biāo)記抗小鼠 CD11b 抗體、PE 標(biāo)記抗小鼠 Gr-1 抗體、PE-Cy5 標(biāo)記抗小鼠 CD3 抗體、PE 標(biāo)記抗小鼠 NK1.1 抗體、PE 標(biāo)記抗小鼠程序性死亡分子（Programmed death-1，PD-1）抗體、FITC 標(biāo)記抗小鼠 CD4 抗體、PE 標(biāo)記抗小鼠 CD8 抗體、PE 標(biāo)記抗小鼠 CD25 抗體、PE 標(biāo)記抗小鼠 F4/80 抗體、PE-Cy5 標(biāo)記抗小鼠Foxp3 抗體、FITC 標(biāo)記抗小鼠 CD11c 抗體、PE 標(biāo)記抗小鼠 MHCII 抗體、APC 標(biāo)記抗小鼠CD86 抗體、PE 標(biāo)記抗小鼠 TCR-β抗體、PE 標(biāo)記抗小鼠程序性死亡分子 1 配體（Programmed death-1 ligands，PD-L1）抗體、rmGM-CSF、rmIL-4、4%多聚甲醛、Mouse IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α ELISA 試劑盒。

1.5  主要儀器

超凈工作臺、CO2 培養(yǎng)箱、熒光倒置顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)、超純水機(jī)、電子天平、流式細(xì)胞儀、恒溫振蕩器、壓力蒸汽滅菌鍋、4℃、-20℃、-80℃冰箱、低速離心機(jī)、多功能酶標(biāo)儀、電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.6  實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1  細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)

H22 細(xì)胞，昆明鼠腹水傳代。

1.6.2  小鼠 H22 肝癌皮下移植瘤模型的建立

小鼠肝癌 H22 細(xì)胞株，于昆明小鼠（KM 小鼠）腹腔內(nèi)傳代保存。腹腔種植小鼠肝癌 H22 細(xì)胞后的第七天（已形成腹水），將 KM 小鼠頸椎脫臼處死，75% 酒精浸泡 5min，無菌條件下用 1ml 注射器 4 號針頭抽取腹水置于 5ml EP 管中。細(xì)胞計數(shù)，確定肝癌 H22 細(xì)胞個數(shù)，調(diào)整肝癌 H22 細(xì)胞濃度為 107 個/ml 生理鹽水（或 PBS）。用 1ml 一次性注射器分別接種至 6 周齡雄性 C57BL/6J 小鼠右前肢腋皮下，每只小鼠注射 0.2ml 細(xì)胞懸液（含細(xì)胞 5*105 個）。接種后，小鼠每天正常進(jìn)食，每天觀察一次，建立小鼠 H22 肝癌皮下移植瘤模型。

1.6.3 試驗(yàn)分組和給藥方法（空白組 10 只，其他組每組 15 只） 空白對照（K）組：正常鼠每天灌胃生理鹽水 0.2ml/只。

Model(M)組：荷瘤鼠每天灌胃生理鹽水 0.2ml/只。

順鉑（CDDP）組：荷瘤鼠隔天腹腔注射 CDDP 4.8mg/kg，連續(xù)注射三周。

今幸膠囊（Jinxing）組：荷瘤鼠每天灌胃 今幸 10mg/kg（前期預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳劑量，該劑量以人參皂苷 Rh2 計。），連續(xù)給藥三周。

CDDP+胸腺五肽（TP-5）組：荷瘤鼠每天腹腔注射 TP-5 0.01mg/kg，隔天腹腔注射 CDDP 4.8 mg/kg，連續(xù)三周。

CDDP+Jinxing 組：荷瘤鼠每天灌胃今幸 10mg/kg，隔天腹腔注射 CDDP 4.8mg/kg，連續(xù)三周。

CDDP(1w)+ TP-5(2w)組：荷瘤鼠隔天腹腔注射 CDDP 4.8 mg/kg，給藥一周，之后每天腹腔注射 TP-5 0.01mg/kg，連續(xù)兩周。

CDDP(1w)+今幸(2w)組：荷瘤鼠隔天腹腔注射 CDDP 4.8 mg/kg，給藥一周， 之后每天灌胃 Jinxing 10mg/kg，連續(xù)兩周。

每天稱量小鼠體重，測量瘤體積，觀察小鼠活動及毛皮顏色等。末次給藥后， 小鼠經(jīng)眼眶取血后，頸椎脫臼處死，取胸腺、淋巴結(jié)、脾臟、肝臟、內(nèi)臟脂肪稱重。分離脾臟、胸腺和淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞以及骨髓來源的 DCs 測定相關(guān)指標(biāo)。

1.6.4  脾、胸腺、淋巴結(jié)細(xì)胞懸液制備

無菌條件下迅速取出脾臟，取部分脾組織制備脾淋巴細(xì)胞。將脾臟組織放入約含 5ml 無菌 PBS 的培養(yǎng)皿內(nèi)，清洗三次，用膠頭滴管研磨脾臟，經(jīng) 100 目尼龍篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液于離心管中。1200r·min-1 離心五分鐘，加入紅細(xì)胞裂解液 1ml，1700r·min-1 離心五分鐘，再用無菌 PBS 洗滌細(xì)胞三遍，用 RPMI-1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。于倒置顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)，細(xì)胞活力測定需＞90%，并調(diào)整細(xì)胞濃度為 2*107 個/ml。（胸腺、淋巴結(jié)細(xì)胞懸液制備方法相同）

1.6.5 脾 T、B 淋巴細(xì)胞增殖

取上述脾細(xì)胞懸液適量稀釋為 3*106 個/ml，0.1ml 接種于 96 孔板，每份樣品設(shè) 3 個復(fù)孔，另加 100μL ConA(5μg/mL)或 100μL LPS(10μg/ml)分別刺激 T、B 淋巴細(xì)胞增殖，同時設(shè)置相應(yīng)對照孔。37℃ 5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h 后，每孔加入 20μL MTT(5μg/mL)，輕輕振搖后繼續(xù)培養(yǎng) 4h。取出培養(yǎng)板 3000r·min-1 離心15min，棄掉上清，每孔加入 150μL DMSO 充分溶解甲瓚，于 490nm 和 570nm處用酶標(biāo)儀檢測 OD 值。

1.6.6 脾臟自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cell，NK）、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）、髓來源的抑制性細(xì)胞（Bone marrow-derived suppressor cells，MDSC）比例及 PD-1 測定

取 100μL 1*107 個/ml PBS 重懸的脾淋巴細(xì)胞懸液，NK 細(xì)胞加入 PE-Cy5 標(biāo)記的小鼠 CD3 抗體和 PE 標(biāo)記的小鼠 NK1.1 抗體；巨噬細(xì)胞加入 APC 標(biāo)記的小鼠 CD11b 抗體和 PE 標(biāo)記的小鼠 F4/80 抗體；TCR 加入 PE-Cy5 標(biāo)記的小鼠CD3 抗體和 PE 標(biāo)記的小鼠 TCR-β抗體；MDSC 加入 APC 標(biāo)記的小鼠 CD11b 抗體和 PE 標(biāo)記的小鼠 Gr-1 抗體；PD-1 加入 PE-Cy5 標(biāo)記的小鼠 CD3 抗體和 PE 標(biāo)記的小鼠PD-1 抗體，4℃避光孵育 1h，加入 1ml PBS，1200r·min-1 離心 5min， 重復(fù)一次，用 300μL PBS 重懸，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞百分率。

1.6.7    CD4+CD8+T 細(xì)胞測定

研磨脾臟、胸腺和淋巴結(jié)，分別制成 1*107 個/ml 的細(xì)胞懸液備用，用 PBS

重懸。取 100μL 1*107 個/ml 脾臟、胸腺細(xì)胞懸液，均加入 PE-Cy5 標(biāo)記的小鼠

CD3 抗體、FITC 標(biāo)記的小鼠 CD4 抗體、PE 標(biāo)記的小鼠 CD8 抗體，4℃避光孵育 1h，加入 1ml PBS，1200r·min-1 離心 5min，重復(fù)一次，用 300μL PBS 重懸， 上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞百分率。

1.6.8    CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Regulatory T cells，Treg）測定

取上述濃度為1*107個/ml的脾臟、胸腺細(xì)胞懸液100μL，按說明書加入FITC 標(biāo)記的小鼠CD4抗體和PE標(biāo)記的小鼠CD25抗體，混勻，4℃避光孵育1h。用flow cytometry staining buffer洗滌細(xì)胞兩次， 1200r·min-1 離心5min。每個樣本加入

fixation/permeabilization工作液800μL，4°C避光反應(yīng)1h。用permeabilization buffer 洗滌細(xì)胞兩次，每次1ml，1700r·min-1離心5min。100μl permeabilization buffer重懸細(xì)胞，加入PE-Cy5標(biāo)記的小鼠Foxp3抗體，4°C避光反應(yīng)1h。用permeabilization buffer洗滌細(xì)胞兩次，每次1ml，1700r·min-1離心5min。300μL permeabilization buffer重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.6.9      樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DCs）的分離和培養(yǎng)

取每只小鼠的脛骨和股骨，洗凈并分離骨髓，100 目尼龍網(wǎng)過濾去除雜質(zhì)， 用無菌 PBS 清洗后得到骨髓細(xì)胞懸液；加入 1ml 紅細(xì)胞裂解液，避光反應(yīng) 2min， 加 3ml PBS 終止，再用 3ml PBS 清洗一遍，計數(shù)板計數(shù)，用 RPMI-1640 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度約為 2*106 個/ml。取 2ml 細(xì)胞懸液加入 6 孔培養(yǎng)板中，再加入rmGM-CSF（20ng/ml）和 rmIL-4（10ng/ml）細(xì)胞因子后在 37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每兩天半換液，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、生長情況及集落的數(shù)量和大小。第七天收集細(xì)胞待用。

1.6.10    DCs 表面分子測定

取 100μL 1*107 個/ml 的 DCs 懸液（PBS 懸浮），加入指定量的流式抗體：

FITC 標(biāo)記的小鼠 CD11c 抗體、PE 標(biāo)記的小鼠 MHCII 抗體、APC 標(biāo)記的小鼠CD86 抗體、PE 標(biāo)記的小鼠 PD-L1 抗體。4℃避光孵育 1h，PBS 洗滌 1 次，1200r·min-1 離心 5min，重復(fù)一次，用 300μL P BS 重懸，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.6.11    ELISA 測血清細(xì)胞因子

在酶標(biāo)板上分別設(shè)空白孔和待測樣品孔。待測樣品孔中加樣品稀釋液 25μL， 然后再加待測血清 25μL，樣品最終稀釋度為 2.5 倍。用封板膜封板后置 37℃孵育 30min。揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒棄去， 重復(fù)5 次。每孔加酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃溫育30min，洗板 5 次。每孔先加入顯色劑 A 50μL，再加入顯色劑 B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色 15min。每孔加入終止液 50μL，于 450nm 處用酶標(biāo)儀檢測 OD 值。

2  實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 腫瘤體積

給藥組腫瘤體積均小于模型組，且腫瘤體積的增長速度更加緩慢（圖 1A）， 單一給藥組，腫瘤指數(shù)均比腫瘤模型（M）組更小，聯(lián)合給藥組腫瘤指數(shù)減小更加明顯（圖 1B），提示 Jinxing 抑癌作用明顯，且與化療藥CDDP 聯(lián)合應(yīng)用時， 抑癌效果更為顯著。

圖 1    A 為給藥后，各組小鼠腫瘤體積隨時間的變化曲線（數(shù)值為每隔一天的，天數(shù)按順序增加，下同）。B 為各組小鼠的腫瘤指數(shù)。

2.2     小鼠體重，死亡率

CDDP 在發(fā)揮抑癌作用的同時，副作用也非常明顯。實(shí)驗(yàn)中CDDP 組及CDDP與TP-5 和今幸聯(lián)合給藥組（CDDP+TP-5、CDDP+Jinxing、CDDP(1w)+ TP-5(2w)、

CDDP(1w)+今幸(2w)），小鼠狀態(tài)很差，精神不振，蜷縮少動，從給藥開始體重下降明顯（圖 1A），并且出現(xiàn)不同程度的死亡。其中，CDDP 組死亡率最高，4 組聯(lián)合給藥組死亡率其次，今幸組的死亡率明顯低于其他組（圖 2B）。今幸組小鼠從給藥后體重雖然增長很慢，但并未下降，只是在疾病后期體重才開始逐漸下降。結(jié)合上部分結(jié)果，提示今幸與 CDDP 聯(lián)合用藥時，能發(fā)揮明顯的抑癌作用，同時也能明顯降低死亡率。

圖 2 A 為各組小鼠的體重隨時間的變化曲線圖。B 為給藥后各組小鼠的死亡率。

2.3  血清中細(xì)胞因子

IL-10 是一種主要由效應(yīng) T 細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎細(xì)胞因子，早期被認(rèn)為具有免疫抑制作用，近年的研究表明IL-10 也可促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng)，可活化 T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞。M 組IL-10 的含量顯著低于K 組，給藥后今幸 組、TP-5 組和CDDP(1w)+TP-5(2w)組明顯升高（圖 3）。提示 今幸可促進(jìn)血清中 IL-10 分泌。

圖 3     為血清中 IL-10 的水平。（#表示與空白組比較，*表示與模型組比較； *P≤0.05，**P≤0.01，***P ≤0.001，#P 同*P。（下同）

2.4   CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞

模型組與空白對照組相比，脾臟和胸腺中的 CD4+T 細(xì)胞 CD8+T 細(xì)胞比例都下降，給藥后出現(xiàn)不同程度地上升：

CD4+T 細(xì)胞（脾臟）（圖 4A）：今幸 組高于CDDP 組，CDDP(1w)+今幸(2w)組高于 CDDP(1w)+TP-5(2w)組；

CD4+T 細(xì)胞（胸腺）（圖 4C）：今幸組高于 CDDP 組；

CD8+T 細(xì)胞（脾臟）（圖 4B）：今幸 組高于 CDDP 組，CDDP+今幸 組高于 CDDP+TP-5 組，CDDP(1w)+今幸(2w)組高于 CDDP(1w)+TP-5(2w)組；

CD8+T 細(xì)胞（胸腺）（圖 4D）：今幸組高于 CDDP 組。

結(jié)果提示單用一種藥物時，今幸能通過上調(diào)脾臟中 CD4+T 細(xì)胞和 CD8+T 細(xì)胞的比例，發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。聯(lián)合用藥時，先用化療藥，再用 Jinxing 效果更好，且對 CD4+T 細(xì)胞和 CD8+T 細(xì)胞的刺激能力強(qiáng)于 CDDP(1w)+TP-5(2w)。（實(shí)驗(yàn)中也檢測了胸腺中聯(lián)合用藥組的CD4+T 細(xì)胞和 CD8+T 細(xì)胞比例，但效果不明顯，圖略。）

圖 4 脾臟、胸腺中 CD4+T 細(xì)胞和 CD8+T 細(xì)胞比例。A 為脾臟中 CD4+T 細(xì)胞的比例。

B 為脾臟中 CD8+T 細(xì)胞的比例。C 為胸腺中 CD4+T 細(xì)胞的比例。D 為胸腺中 CD8+T 細(xì)胞的比例。

2.5   脾臟中 NK 細(xì)胞

模型組 NK 細(xì)胞比例低于正常組，給藥后比例均上升。今幸 組高于 CDDP 組，CDDP(1w)+今幸(2w)組高于 CDDP(1w)+TP-5(2w)組，CDDP+今幸 組高于 CDDP+TP-5 組。結(jié)果提示，單用 今幸 或先用 CDDP 再用 今幸 都能促進(jìn)NK 細(xì)胞增殖，增強(qiáng)免疫，今幸 與化療藥 CDDP 同時使用效果不明顯。

2.6     脾臟中免疫抑制細(xì)胞

MDSC（圖 6A）：模型組 MDSC 比例高于空白對照組，給藥后除 CDDP 組和 CDDP+TP-5 組外，其他組均下降。CDDP+J今幸 組下降程度最大，其次為今幸 組、CDDP(1w)+今幸(2w)組。提示 今幸單用或與 CDDP 聯(lián)合用藥都能下調(diào)脾臟中的 MDSC，發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。

Tregs（圖 6B）：與空白組相比，模型組、CDDP 組和 今幸 組 Treg 比例稍低于空白對照組。提示單用 今幸 能下調(diào) Treg，發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。

圖 6 脾臟中 MDSC 和 Treg 的比例。A 為脾臟中 MDSC 的比例。B 為脾臟中 Treg 的比例。

2.7 脾臟中 TCR

脾臟中模型組 TCR 比例低于空白對照組，給藥后除 CDDP 組，TCR 比例都上 調(diào) 。今幸 組 高 于 CDDP 組 ， CDDP(1w)+Jinxing(2w) 組 高 于CDDP(1w)+TP-5(2w)組，CDDP+今幸 組高于 CDDP+TP-5 組，說明 Jinxing 對脾臟中的 TCR 有明顯的上調(diào)作用，且與 CDDP 聯(lián)合用藥時效果強(qiáng)于 TP-5。

2.8 骨髓來源的 DCs共刺激分子 CD86（圖 8A）：模型組比例下降，給藥后除 CDDP 組外都上調(diào) ， 今幸高 于 CDDP 組 ， CDDP+TP-5 組 高 于 CDDP+Jinxing 組 ， CDDP(1w)+TP-5(2w)組高于 CDDP(1w)+今幸(2w)組，說明 Jinxing 能上調(diào) DC 表面的 CD86 分子，且單用時上調(diào)效果更明顯。

DCs 表型 MHCII（圖 8B）：模型組 MHCII 比例低于空白對照組，給藥后比例均上調(diào)。今幸 組高于 CDDP 組，CDDP+今幸 組高于 CDDP+TP-5 組，CDDP(1w)+今幸(2w)組高于 CDDP(1w)+TP-5(2w)組，提示 今幸 對 MHCII分子有明顯的上調(diào)作用，且聯(lián)合用藥時效果強(qiáng)于 TP-5。

脾臟中 PD-1/DCs 表面 PD-L1（圖 8C、8D）：模型組脾臟表面的 PD-1 分子比例高于空白組，Jinxing 組低于 CDDP 組，CDDP+Jinxing 組高于 CDDP+TP-5 組，CDDP(1w)+今幸(2w)組高于 CDDP(1w)+TP-5(2w)組。模型組 DCs 表面的PD-L1 分子表達(dá)較空白組高，今幸 組低于 CDDP 組，CDDP+今幸 組低于CDDP+TP-5 組， CDDP(1w)+今幸(2w) 組高于 CDDP(1w)+TP-5(2w) 組， 由于PD-1 與 PD-L1 結(jié)合發(fā)揮免疫抑制作用，因此結(jié)果提示今幸 單用能同時下調(diào)脾臟表面的 PD-1 分子和 DCs 表面的 PD-L1 分子，發(fā)揮免疫增強(qiáng)的作用。

3  實(shí)驗(yàn)結(jié)論

圖 8 DCs 的表面分子比例。A 為 DCs 表面共刺激分子 CD86。B 為 DCs 表型 MHCII。C 為脾臟表面 PD1 分子。D 為 DCs 表面 PD-L1 分子。

研究結(jié)果表明：

1、今幸膠囊與化療藥 CDDP 聯(lián)合用藥具有明顯的抑癌作用。

2、今幸膠囊沒有明顯副作用，在治療過程中基本能穩(wěn)定小鼠的體重，使小鼠保持較好的生理狀態(tài)。而化療藥 CDDP 雖然抑癌明顯，但副作用很大，小鼠體重下降明顯，死亡率很高，今幸膠囊與 CDDP 聯(lián)合用藥后能降低小鼠死亡率。

3、今幸膠囊能增加脾臟、胸腺中的 CD4+T 細(xì)胞和 CD8+T 細(xì)胞，NK 細(xì)胞和 TCR， 降低脾臟中 MDSC 和 Treg 細(xì)胞，促進(jìn) DCs 表面 CD86 和 MHCII 分子表達(dá)，促進(jìn) DCs 的成熟，降低 PD-1 與 PD-L1，發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。與 CDDP 聯(lián)合用藥時， 今幸膠囊與免疫增強(qiáng)劑 TP-5 相比，今幸膠囊對脾臟中 CD4+T 細(xì)胞和 CD8+T 細(xì)胞、TCR 的上調(diào)作用，對DCs 表面的 MHCII 分子的上調(diào)作用，均強(qiáng)于 TP-5 與CDDP 聯(lián)合用藥。今幸膠囊還可促進(jìn)血清中 IL-10 的分泌，間接調(diào)節(jié)免疫功能。

4、實(shí)驗(yàn)中采用今幸膠囊的劑量以人參皂苷 Rh2 計為 10mg/kg，根據(jù)今幸膠囊中人參皂苷 Rh2 含量以及人和小鼠給藥劑量換算，該劑量與產(chǎn)品說明書上日服用量基本一致。