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文章背景簡(jiǎn)介

BACKGROUND INTRODUCTION

褐藻膠是由β－D－甘露糖醛酸（M）及其C5差向異構(gòu)體α－L－古羅糖醛酸（G）通過(guò)α／β－1，4糖苷鍵隨機(jī)排列而成的一種酸性多糖，這兩種糖單元相互聚合形成三種不同的結(jié)構(gòu)單元：聚甘露糖醛酸（PolyM）、聚古羅糖醛酸（PolyG）及M和G隨機(jī)組合形成的雜聚物（PolyMG）。褐藻膠裂解酶廣泛存在于生長(zhǎng)在海水、土壤和海洋藻類的微生物中，以弧菌、假單胞菌、固氮菌、芽孢桿菌、黃桿菌等海洋細(xì)菌最為常見，在少數(shù)真菌和病毒中也有褐藻膠裂解酶的存在。

褐藻膠裂解酶是一種專性裂解褐藻膠的多糖降解酶，可通過(guò)β消除反應(yīng)切斷酸性褐藻膠多糖糖苷鍵，并在新生成的非還原端C4，5 間產(chǎn)生具有不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)的寡糖產(chǎn)物。褐藻膠裂解酶按其對(duì)底物降解方式的不同分為多聚α－L－1，4－ 古羅糖醛酸裂解酶、多聚β－D－1，4－ 甘露糖醛酸裂解酶及兩種片段都能裂解的雙功能裂解酶。褐藻膠的降解產(chǎn)物褐藻寡糖在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域都具有巨大的利用潛力，有研究表明其在抗氧化、抗腫瘤、抗凝血、抗真菌、神經(jīng)保護(hù)、腸道消化吸收及植物的生長(zhǎng)及保鮮等方面表現(xiàn)出良好的生物活性。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有細(xì)胞外蛋白分泌能力強(qiáng)、分離方便、無(wú)內(nèi)毒素生成等優(yōu)點(diǎn)。該系統(tǒng)通常是工業(yè)生產(chǎn)重組蛋白的首選，但目前還沒(méi)有褐藻膠裂解酶在畢赤酵母系統(tǒng)中重組表達(dá)的報(bào)道。對(duì)畢赤酵母在褐藻膠裂解酶生產(chǎn)中的潛在應(yīng)用進(jìn)行研究具有很好的研究?jī)r(jià)值。

2018年，杭州師范大學(xué)的Haifeng Li等人在《Marine Drugs》（IF2018＝4．379，醫(yī)學(xué)2區(qū)）發(fā)表了題為“High－Level Expression of a Thermally Stable Alginate Lyase Using Pichia pastoris， Characterization and Application in Producing Brown Alginate Oligosaccharide”的文章。在本研究中，對(duì)黃桿菌H63的褐藻酸裂解酶基因sagl在畢赤酵母中成功進(jìn)行了表達(dá)，并獲得了較高的產(chǎn)量。在此之前，由于包涵體問(wèn)題，sagl基因在大腸桿菌中并沒(méi)有得到很好的表達(dá)。同時(shí)，該研究對(duì)酵母生產(chǎn)的重組海藻酸裂解酶的特性進(jìn)行了詳細(xì)的研究。此外，利用該重組酶對(duì)褐藻酸寡糖的大規(guī)模生產(chǎn)進(jìn)行了研究。

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所用到的主要方法

METHODS

1．大腸桿菌和畢赤酵母重組表達(dá)；

2．SDS－PAGE；

3．Western blot；

4．去糖基化；

5．TLC薄層色譜；

6．ESI－MS；

7．氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建與分析

03

文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

本文將來(lái)源于黃曲霉H63的褐藻膠裂解酶基因sagl在密碼子優(yōu)化后在畢赤酵母中通過(guò)高密度發(fā)酵實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，在酵母培養(yǎng)上清中sagl（rSAGL）重組酶的最高產(chǎn)量達(dá)到226．4 μg／mL（915．5 U／mL）。這是迄今為止海藻酸鈉裂解酶重組表達(dá)的最高產(chǎn)量。rSAGL通過(guò)EndoH消化證實(shí)為部分糖基化蛋白。該酶的最佳反應(yīng)溫度為45°C、最適pH為7．5；在80 mM K＋濃度下最多可使酶的催化活性提高244％。rSAGL是一種熱穩(wěn)定酶，T5015為57～58°C，T5030為53～54°C，其熱穩(wěn)定性優(yōu)于任何已知的海藻酸鈉裂解酶。在pH為6的100 mM磷酸鹽緩沖液中，rSAGL在50°C孵育2h后可保留98．8％的初始活性，在同樣溫度48 h后仍可保留初始活性的61．6％。通過(guò)畢赤酵母生產(chǎn)純化后的rSAGL的特異活性可達(dá)到4044 U／mg，這是迄今為止海藻酸鈉裂解酶的第二高記錄。當(dāng)rSAGL粗酶直接用于轉(zhuǎn)化40 g／L的海藻酸鈉，在50℃培養(yǎng)32小時(shí)后，可以將97．2％的底物轉(zhuǎn)化成二、三、四糖�；旌衔镏羞�原糖的最終濃度達(dá)到9．51 g／L。這是首次利用畢赤酵母系統(tǒng)高表達(dá)熱穩(wěn)定的褐藻膠裂解酶。

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相關(guān)鏈接

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新型雙功能褐藻膠裂解酶構(gòu)效關(guān)系分析及在褐藻寡糖制備中的應(yīng)用