傳統(tǒng)的組織病理學(xué)處理組織包括固定、包埋、切片和染色等過程，會(huì)導(dǎo)致所得圖像變形偽影且某些生物信息缺失，這對(duì)于醫(yī)生對(duì)圖像的觀察和解釋都會(huì)造成影響，并且這個(gè)過程會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間。

對(duì)于非線性光學(xué)顯微鏡，通過不同的激發(fā)光能實(shí)現(xiàn)不同的非線性成像過程，不同的非線性成像過程是由生物樣品中不同的內(nèi)源性生物分子引起的，這就說明不同的激發(fā)光能夠“人工”的標(biāo)記各種內(nèi)源性生物分子，而不需要外源性染色劑或其他熒光劑進(jìn)行“物理”標(biāo)記，并且這些非線性成像過程都可以在實(shí)現(xiàn)CARS的多模態(tài)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)。

圖1中的三個(gè)系統(tǒng)都是比較常見的CARS顯微鏡系統(tǒng)，這些系統(tǒng)存在兩個(gè)問題：第一，圖中固體激光器直接出射的激光（“紅色”光束）打到顯微鏡系統(tǒng)里，激光器的光束指向隨時(shí)間和溫度可能會(huì)漂移，指向不穩(wěn)定性容易受到日常變化的影響，直接影響顯微鏡系統(tǒng)的成像，所以需要經(jīng)常對(duì)進(jìn)入顯微鏡的光束進(jìn)行重新對(duì)準(zhǔn)。

圖1c中激光器出射的光束通過分束器分為兩路，下面那路通過光子晶體光纖產(chǎn)生超連續(xù)譜（“綠色”光束），此時(shí)激光源的光束漂移只會(huì)影響到激光束與光子晶體光纖的耦合，進(jìn)而影響從光纖中出射的超連續(xù)譜的能量，而不會(huì)直接影響后面的顯微鏡系統(tǒng)，但分束后上路的“紅色”光束仍存在上面描述的問題。第二，實(shí)現(xiàn)CARS的多模態(tài)系統(tǒng)如何選擇光源是一個(gè)需要考慮的問題，多模態(tài)系統(tǒng)通常需要飛秒脈沖來激發(fā)多光子熒光、諧波生成等過程，但是飛秒脈沖光譜較寬，用于CARS成像時(shí)遠(yuǎn)大于大多數(shù)分子振動(dòng)特征峰的尺度（10cm－1）， 使得CARS的光譜分辨率較低，所以CARS顯微鏡一般使用皮秒激光器作為光源來獲得較高的光譜分辨率。

圖1 常見的CARS顯微鏡系統(tǒng)

2016年，Haohua Tu等人提出的無標(biāo)記的多模態(tài)非線性成像系統(tǒng)比較好的解決了上面的兩個(gè)問題，具體光路圖如圖2，光源為Yb： KYW激光器（1，041 nm， 220 fs， 80 MHz），使用一種保偏的全正色散的光子晶體光纖產(chǎn)生寬帶單模超連續(xù)譜（780－1320 nm），光子晶體光纖放到激光器的后面、分束器的前面，這樣就能保證分束后的兩條光路都不會(huì)由于激光源的光束漂移而導(dǎo)致這兩條光路的光束指向不穩(wěn)定，進(jìn)而影響后面的顯微鏡系統(tǒng)。

激光源的光束漂移只會(huì)影響到激光束與光子晶體光纖的耦合，為了減小這種影響，又使用反饋控制回路將光子晶體光纖的輸出（輸入）耦合功率保持在480 mW （800 mW）。接著通過離軸拋物面鏡對(duì)輸出的超連續(xù)譜進(jìn)行準(zhǔn)直，又通過二向色鏡將光束分離為CARS泵浦光束（780－880 nm）和CARS斯托克斯光束（900－1，320 nm）。斯托克斯光束進(jìn)入商用脈沖整形器中，不僅用于CARS成像，還用于2PAF，SHG，3PAF和THG成像。然后，兩路光束通過另一個(gè)二向色鏡合束，并通過消色差物鏡（NA ＝ 1．20）聚焦，消色差物鏡能夠?qū)崿F(xiàn)衍射極限成像。

其中，脈沖整形器可以用于對(duì)脈沖振幅整形，進(jìn)行頻譜選擇，讓不同波長的光通過，激發(fā)不同的非線性成像。還可以進(jìn)行相位整形，用來補(bǔ)償相位，獲得變換極限脈沖，來激發(fā)SHG／THG／3PEF／2PEF；另外，斯托克斯脈沖通過脈沖整形器還能引入啁啾，通過電動(dòng)裝置調(diào)節(jié)啁啾后的斯托克斯脈沖與泵浦脈沖之間的光學(xué)延遲，實(shí)現(xiàn)“光譜聚焦”，這種“光譜聚焦”的方式可以提高飛秒CARS的光譜分辨率，最后得到的該系統(tǒng)的光譜分辨率為14 cm－1。

并且使用者能對(duì)整形器的振幅－相位掩模進(jìn)行預(yù)編程，這樣激光脈沖通過脈沖整形器后就會(huì)發(fā)生不同的改變，對(duì)應(yīng)不同的非線性成像過程也就是激發(fā)不同的內(nèi)源性物質(zhì)。換一種說法就是激光在進(jìn)行激發(fā)時(shí)作為可編程的變量，用脈沖整形器實(shí)現(xiàn)對(duì)激光的預(yù)編程，編程好的不同激光可用來激發(fā)不同的內(nèi)源性物質(zhì)（表1）。通過編程進(jìn)一步將脈沖整形器變化脈沖與切換檢測通道相匹配，就能做到激發(fā)和檢測的匹配。

這樣，未經(jīng)過激光和顯微鏡培訓(xùn)的操作員在使用該成像系統(tǒng)時(shí)，能夠有選擇地在計(jì)算機(jī)屏幕上查看特定的內(nèi)源性物質(zhì)，通過按下預(yù)編程的按鈕可以立即（可以遠(yuǎn)程進(jìn)行）將當(dāng)前成像物質(zhì)更改為其他物質(zhì)，激發(fā)和檢測過程無需進(jìn)行組織染色和激光的重新對(duì)準(zhǔn)。

圖2 無標(biāo)記的多模態(tài)非線性成像系統(tǒng)

表1 預(yù)編程的激發(fā)／檢測參

該組使用該系統(tǒng)對(duì)大鼠的乳腺腫瘤進(jìn)行了成像，在不同的非線性圖像及它們的復(fù)合圖像中（圖3、圖4）觀察到了正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的區(qū)別以及乳腺腫瘤生成的多個(gè)特征，與傳統(tǒng)組織病理學(xué)作比較，發(fā)現(xiàn)大部分特征在傳統(tǒng)組織病理學(xué)的圖像中都觀察不到，這也證明了無標(biāo)記的多模態(tài)非線性成像系統(tǒng)的優(yōu)勢。

圖3 乳腺標(biāo)本的非線性多模態(tài)圖像及其相應(yīng)的FFPE–H＆E組織學(xué)圖像

圖4 乳腺標(biāo)本的三模態(tài)圖像中顯示出的局部腫瘤浸潤的光學(xué)特征

總之，Haohua Tu等人提出的無標(biāo)記的多模態(tài)非線性成像系統(tǒng)有多個(gè)優(yōu)勢，他們將光子晶體光纖放到了激光器的后面，避免了激光源的光束漂移直接影響到顯微鏡成像；使用“光譜聚焦”的方式提高了飛秒CARS的光譜分辨率；用脈沖整形器實(shí)現(xiàn)對(duì)激光的預(yù)編程，編程好的不同激光用來激發(fā)不同的內(nèi)源性物質(zhì)，通過編程進(jìn)一步將脈沖整形器變化脈沖與切換檢測通道相匹配，方便操作人員的使用。

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多光子顯微鏡成像技術(shù)之八：大視場多區(qū)域腦成像技術(shù)

參考文獻(xiàn)

［1］ Tu， H．， Liu， Y．， Turchinovich， D． et al． Stain－free histopathology by programmable supercontinuum pulses． Nature Photon 10， 534–540 （2016）．