酸奶中的益生菌如何與骨外科手術(shù)聯(lián)系在一起?
作為很多人的心頭好,酸奶稱得上是一種美味、健康兼得的飲品。它不僅保留了牛奶本身的香濃和營(yíng)養(yǎng),而且因?yàn)榻?jīng)歷了發(fā)酵過程而擁有酸甜可口、易消化吸收的特點(diǎn)。不僅如此,酸奶中含有的益生菌已被證實(shí)有益人體消化系統(tǒng)健康,甚至可以被用于治療或緩解消化道疾病。
然而,你能想到酸奶還能為改良骨外科手術(shù)帶來啟發(fā)嗎?
最近,來自湖北大學(xué)、天津大學(xué)、西安交通大學(xué)、北京大學(xué)、香港大學(xué)和華中科技大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)從酸奶中的一種益生菌“身上”找到了靈感。
他們通過在鈦種植體表面培養(yǎng)干酪乳桿菌得到了菌膜覆蓋的改良種植體,并驗(yàn)證了改良種植體具有抵抗致病菌感染、促進(jìn)骨結(jié)合的作用,以及應(yīng)用于骨外科種植體手術(shù)的潛力。相關(guān)工作以“Engineered probiotics biofilm enhances osseointegration via immunoregulation and anti-infection”為題,于 11 月 13 日發(fā)表在《科學(xué)進(jìn)展》(Science Advances)雜志上。
(來源:Science Advances)
用菌膜改良種植體的設(shè)想
那么,問題來了,研究人員是如何將酸奶中的益生菌與骨外科手術(shù)聯(lián)系在一起的?
骨外科手術(shù)是修復(fù)嚴(yán)重骨折、骨骼畸形的必要方法。骨外科手術(shù)中常使用金屬種植體(implant)固定損傷的骨骼,來輔助骨骼愈合或維持正常的骨骼形態(tài)。種植體在植入人體后需要能夠與骨骼形成骨結(jié)合(osseointegration),即種植體和骨骼直接接觸形成骨組織連接,而之間沒有任何其他組織間隔。因此,種植體材料通常為生物相容性好的金屬,比如鈦和鈦合金。
在骨外科種植體手術(shù)中,種植體與人體組織連接處的致病菌感染和成骨活性不足是導(dǎo)致手術(shù)失敗、康復(fù)緩慢的兩個(gè)主要因素,這些情況的發(fā)生也會(huì)增加醫(yī)療成本和患者的病痛。
為解決這兩個(gè)難題,現(xiàn)有方案通常會(huì)使用抗生素類藥物或重金屬?gòu)?fù)合抗菌材料(如銀鋅復(fù)合材料),來預(yù)防致病菌感染;使用骨肽和生長(zhǎng)因子等促成骨藥物進(jìn)行輔助。
然而,這些方案遠(yuǎn)非最優(yōu)解:抗生素類藥物有破壞人體有益菌群、導(dǎo)致多重感染、產(chǎn)生耐藥病菌的風(fēng)險(xiǎn);重金屬具有生物毒性,與種植體生物相容性的要求相悖;而外源添加促成骨因子則需要精細(xì)設(shè)計(jì)和嚴(yán)格配比,使用起來也并不簡(jiǎn)便。
如果換一種思路,從種植體方面進(jìn)行改良又如何?
針對(duì)前文提出的問題,理想的種植體應(yīng)該相應(yīng)地滿足兩個(gè)條件:
(1)具有較高的生物活性,能夠促進(jìn)骨骼組織的生成,使種植體和骨骼可以較快地產(chǎn)生骨結(jié)合;
(2)具有抵抗耐藥性致病菌感染的能力,能夠防止術(shù)中和術(shù)后感染。
于是,研究人員把目光轉(zhuǎn)向了在醫(yī)學(xué)研究中越來越受到重視的微生物,更具體地說,是已經(jīng)被廣泛用于食品工業(yè)中、對(duì)人體安全且有益的一類微生物——益生菌。
眾所周知,益生菌在人體內(nèi)扮演著維持消化道健康的重要角色,具有消殺致病菌、調(diào)節(jié)宿主消化和免疫系統(tǒng)的作用。因此,益生菌被廣泛應(yīng)用于治療多種消化道疾病,比如炎癥性腸道疾病、腸易激綜合征、感染性腹瀉等。此外,益生菌還能應(yīng)用于改善炎癥性疾病和促進(jìn)組織再生。
但是,活菌進(jìn)入血液可能帶來菌血癥和敗血癥的風(fēng)險(xiǎn),所以大部分益生菌必須口服攝入,這給臨床應(yīng)用帶來了局限性。
作為“健康三益菌”之一,干酪乳桿菌(Lactobacillus casei, L. casei)是酸奶中常見的益生菌,在酸奶發(fā)酵工業(yè)中被廣泛使用。它可以產(chǎn)生細(xì)菌素、乳酸、過氧化氫等抗菌物質(zhì),且對(duì)于多種致病菌都展現(xiàn)出了優(yōu)秀的抗菌性能。同時(shí),它的細(xì)胞壁還含有肽聚糖、脂磷壁酸等物質(zhì),能夠調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)。但是,出于對(duì)敗血癥風(fēng)險(xiǎn)的擔(dān)憂,此前的研究還未探索過將干酪乳桿菌應(yīng)用于外科手術(shù)的可行性。
種植體植入人體后,會(huì)引起異體排斥反應(yīng)和初步炎癥反應(yīng)。在這個(gè)過程中,人體巨噬細(xì)胞(Macrophage)會(huì)聚集在種植體表面。巨噬細(xì)胞的活動(dòng)對(duì)于調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和組織再生具有重要作用,它們能夠分泌成骨因子,如抑癌蛋白M(oncostatin M, OSM)。成骨因子能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)成骨分化,促進(jìn)骨組織生成、種植體和骨骼產(chǎn)生骨融合。而多糖(如脂多糖)能夠激活巨噬細(xì)胞表面的相關(guān)受體(Toll-like receptor, TLR),使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生成骨因子。
細(xì)菌附著在物體表面,進(jìn)行繁殖、分化和分泌胞外基質(zhì),形成有組織的膜狀聚集體,稱為“菌膜”(biofilm)。菌膜主要由細(xì)菌和其周圍的胞外聚合物(extracellular polymeric substance, EPS)基質(zhì)組成,而干酪乳桿菌的細(xì)胞壁和EPS中都含有脂多糖。
研究者們?cè)O(shè)想,在種植體表面覆蓋一層干酪乳桿菌菌膜進(jìn)行改良,植入后巨噬細(xì)胞聚集在種植體周圍,而種植體表面的菌膜中含有的多糖就可以刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生成骨因子,促進(jìn)骨融合。
圖 | 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)想(來源:Science Advances)
在種植體表面覆蓋一層干酪乳桿菌菌膜,在安全無害的同時(shí),還應(yīng)該具有抗耐藥性致病菌和促進(jìn)骨結(jié)合的功能。這正是改良種植體、解決手術(shù)難題的可能方案。
為種植體“鍍”上一層安全菌膜
研究人員用堿熱處理的鈦(AHT-Ti)種植體作為培養(yǎng)基質(zhì),在其表面培養(yǎng)干酪乳桿菌,培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為3天,使種植體表面覆蓋干酪乳桿菌菌膜。堿熱處理的作用是使鈦種植體表面生物活性增加,利于生物細(xì)胞的黏附和增殖,促進(jìn)菌膜的形成和種植體骨結(jié)合,即“活化”。
如何解決活細(xì)菌進(jìn)入血液導(dǎo)致敗血癥的風(fēng)險(xiǎn)呢?研究人員對(duì)覆蓋菌膜的種植體進(jìn)行了短時(shí)間紫外線輻射滅活,在殺死細(xì)菌的同時(shí)保留了菌膜中的活性物質(zhì)。對(duì)滅活后的菌膜進(jìn)行活性檢驗(yàn)染色(活菌呈綠色,死菌呈紅色),染色后的菌膜呈現(xiàn)紅色熒光(如下圖C),說明菌膜中的細(xì)菌被成功滅活。
通過這種方式,研究人員成功得到了干酪乳桿菌菌膜覆蓋的活化鈦種植體(L. casei-AHT-Ti)。
圖 | L. casei-AHT-Ti的表面(來源:Science Advances)
此外,為驗(yàn)證菌膜是否“不懼”耐藥性致病菌,研究人員選用了目前臨床手術(shù)中常見的廣譜耐藥性致病菌——耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)進(jìn)行了測(cè)試。
實(shí)驗(yàn)用未活化的鈦種植體、堿熱處理活化的鈦種植體作為活化鈦種植體的兩個(gè)對(duì)照組。在三組種植體上分別接種MRSA進(jìn)行培養(yǎng),每2個(gè)小時(shí)測(cè)量一次菌液的光密度(optical density, OD),共培養(yǎng)12小時(shí)。用得到的數(shù)據(jù)繪制OD曲線(如下圖E)。
圖 | 抗MRSA性能測(cè)試(來源:Science Advances)
OD數(shù)值越大,菌液中細(xì)菌濃度越高、數(shù)量越多,說明MRSA增殖越活躍,種植體樣本的抗致病菌性能越差。從OD曲線圖中可以看出,在12小時(shí)的培養(yǎng)過程中,活化鈦種植體的OD曲線明顯低于鈦種植體、堿熱處理活化的鈦種植體,這說明活化鈦種植體在抑制MRSA的能力方面表現(xiàn)更佳。在后續(xù)的涂布平板實(shí)驗(yàn)中,活化鈦種植體的MRSA菌落數(shù)量更是比其他兩者減少了三個(gè)數(shù)量級(jí),抗MRSA的效率達(dá)到了驚人的99.98%。
但是,從圖F又可以看出,菌膜培養(yǎng)時(shí)間為1天和2天的堿熱處理鈦種植體(L. casei-AHT-Ti-1、L. casei-AHT-Ti-2)相比于菌膜培養(yǎng)時(shí)間為3天的L. casei-AHT-Ti抗菌性能明顯下降。研究人員檢測(cè)了菌膜中抗菌活性物質(zhì)乳酸(Lactic acid)和過氧化氫(H2O2)的含量,發(fā)現(xiàn)乳酸含量有明顯的減少。通過SDS-PAGE檢測(cè)抗菌活性物質(zhì)細(xì)菌素(bacteriocin)的分泌量,發(fā)現(xiàn)L. casei-AHT-Ti最高。根據(jù)這些結(jié)果推測(cè),乳酸和細(xì)菌素可能是L. casei-AHT-Ti發(fā)揮抗菌性能的主要功能物質(zhì)。
“喚醒”巨噬細(xì)胞、“推進(jìn)”成骨分化
為驗(yàn)證L. casei-AHT-Ti是否有激活巨噬細(xì)胞(Macrophage)的性能,研究人員進(jìn)行了多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。
研究人員首先對(duì)三組種植體樣本表面的巨噬細(xì)胞進(jìn)行DAPI(呈藍(lán)色)和FITC-phalloidin(呈紅色)染色,以觀察種植體表面分布的巨噬細(xì)胞的形態(tài)和生存能力(如下圖A、B),。結(jié)果顯示,L. casei-AHT-Ti表面的巨噬細(xì)胞與對(duì)照組相比無明顯差異,這說明L. casei-AHT-Ti對(duì)巨噬細(xì)胞沒有毒性。
之后,研究人員用RT-PCR分別檢測(cè)了三組種植體樣本表面巨噬細(xì)胞的成骨因子OSM、促炎癥因子TNF-α、抑炎癥因子IL-10的表達(dá)量(如下圖C、D、E)。OSM、TNF-α、IL-10能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的骨性分化。可以發(fā)現(xiàn),L. casei-AHT-Ti表面巨噬細(xì)胞表達(dá)OSM、TNF-α、IL-10相比對(duì)照組都有明顯增多。由此可以推測(cè),L. casei-AHT-Ti可能具有激活巨噬細(xì)胞分泌成骨過程相關(guān)細(xì)胞因子的作用。
圖 | 激活巨噬細(xì)胞性能測(cè)試(來源:Science Advances)
除此之外,研究人員還發(fā)現(xiàn)L. casei-AHT-Ti表面巨噬細(xì)胞的多個(gè)成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)(如下圖B、C),其中包括能與菌膜中的多糖結(jié)合激活巨噬細(xì)胞的脂多糖受體CD14,與巨噬細(xì)胞生產(chǎn)OSM相關(guān)的COX2、PGE2、EPR,以及調(diào)控炎癥反應(yīng)的IL-1b、IL-6、TNF-α、IL-10。
據(jù)此,研究人員提出了L. casei-AHT-Ti激活巨噬細(xì)胞、促進(jìn)骨生成的完整過程(下圖D):干酪乳桿菌菌膜與巨噬細(xì)胞接觸,菌膜中的脂多糖與巨噬細(xì)胞膜上的CD14結(jié)合,激活TLR,促使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥因子IL-1b、IL-6、TNF-α和生產(chǎn)OSM相關(guān)的COX2、PGE2、EPR,促進(jìn)初步炎癥反應(yīng)和成骨因子OSM的生成,刺激成骨細(xì)胞分化。
圖 | 促使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生骨誘導(dǎo)細(xì)胞因子(來源:Science Advances)
成骨因子的分泌量增加后,能否成功誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞骨性分化?為了驗(yàn)證這一點(diǎn),研究人員用三組樣本的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)溶液分別對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行孵育,成功證明了L. casei-AHT-Ti能夠在體外實(shí)驗(yàn)條件下增加間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。
具備應(yīng)用于骨外科手術(shù)的潛力
但是,要想證明L. casei-AHT-Ti有應(yīng)用于骨外科手術(shù)的潛力,僅有體外實(shí)驗(yàn)作為支持是不夠的。于是,研究人員用大鼠進(jìn)行了每組樣本量為3的體內(nèi)實(shí)驗(yàn),他們給脛骨骨折的大鼠分別手術(shù)植入了三種種植體,并添加了一組在術(shù)中在種植處添加MRSA的實(shí)驗(yàn),以檢驗(yàn)大鼠體內(nèi)條件下不同種植體的骨結(jié)合和抗致病菌性能。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在體內(nèi)條件下,L. casei-AHT-Ti也展現(xiàn)出比兩組對(duì)照種植體更優(yōu)的性能。
在添加MRSA的術(shù)后12小時(shí)進(jìn)行的涂布平板實(shí)驗(yàn)中,L. casei-AHT-Ti相比于Ti的抗MRSA效率為98.1%,;根據(jù)無菌條件術(shù)后4周進(jìn)行的三維顯微CT計(jì)算骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV),以及根據(jù)VG固定染色計(jì)算骨面積比率(bone area ratio),L. casei-AHT-Ti的數(shù)值都顯著高于兩組對(duì)照種植體。這些結(jié)果證明了,L. casei-AHT-Ti在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)條件下具有抵抗致病菌感染和促進(jìn)骨生成、骨結(jié)合的性能。
以上結(jié)果表明,L. casei-AHT-Ti在體外和大鼠體內(nèi)都具有抗耐藥性致病菌MRSA和激活巨噬細(xì)胞、促進(jìn)成骨分化和骨結(jié)合的作用。用干酪乳桿菌菌膜改良鈦種植體的成功嘗試,為骨外科手術(shù)提供了一條安全性高、富有潛力的新思路。
那么,你是否看好酸奶益生菌這樣“硬核”的打開方式?
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