因?yàn)閱晤w粒冷凍電鏡厚積薄發(fā)的技術(shù)突破，結(jié)構(gòu)生物學(xué)在2013年底經(jīng)歷了一場(chǎng)“分辨率革命 （resolution revolution） ”，從此幾家歡喜幾家愁。歡喜的是，之前許多讓科學(xué)家們束手無(wú)策的生物大分子們紛紛被揭開(kāi)了神秘面紗；愁的是，作為研究者，為伊消得人憔悴、驀然回首卻在燈火闌珊處的樂(lè)趣少了許多。

但是科研永無(wú)止境。過(guò)去十幾年，每當(dāng)有人問(wèn)我結(jié)構(gòu)生物學(xué)的未來(lái)，我的答案從未改變：“實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞內(nèi)部近原子分辨率的結(jié)構(gòu)”。目前還沒(méi)有技術(shù)可以達(dá)到這一時(shí)空分辨率，而最接近的就是cryo－ET （冷凍電鏡斷層成像）�？梢灶A(yù)見(jiàn)，這個(gè)技術(shù)的不斷發(fā)展終將帶來(lái)另一場(chǎng)分辨率革命，其意義輻射生命科學(xué)許多分支。

Cryo－ET仍舊處于蓬勃發(fā)展的階段，在我赴普林斯頓任教前的幾個(gè)月，成功幫清華引進(jìn)了年輕的Cryo－ET專家李賽博士。過(guò)去三年，我也一直在努力幫普林斯頓大學(xué)招聘cryo－ET方面的人才，現(xiàn)在卻依然是進(jìn)行時(shí)，因?yàn)檫@個(gè)領(lǐng)域的人才確實(shí)是鳳毛麟角。《返樸》邀請(qǐng)李賽博士撰稿，簡(jiǎn)要介紹cryo－ET的原理和發(fā)展，以饗讀者。

——顏寧

撰文 ｜ 李賽（清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心研究員）、徐家璐（李賽實(shí)驗(yàn)室博士研究生）

病毒，是直徑100 nm左右的超大分子復(fù)合物。它的尺寸恰好在電子顯微鏡的透射范圍內(nèi)，為了探明病毒的結(jié)構(gòu)，需要不斷優(yōu)化電子顯微鏡的功能和電鏡數(shù)據(jù)的處理方法�？梢哉f(shuō)，現(xiàn)代冷凍電鏡方法學(xué)是與結(jié)構(gòu)病毒學(xué)手牽手一起發(fā)展的。

冷凍電子顯微鏡——“眼見(jiàn)為實(shí)”的魅力

無(wú)論是列文虎克等科學(xué)家通過(guò)光學(xué)顯微鏡將細(xì)胞的結(jié)構(gòu)展現(xiàn)在世人的面前，還是沃森和克里克發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，揭示基因遺傳的分子機(jī)制，都向我們證明了科學(xué)研究中“眼見(jiàn)為實(shí)”的魅力。生命科學(xué)所研究的大多數(shù)情境，都發(fā)生在極為微小的細(xì)胞中。一個(gè)細(xì)胞的尺度可能比一根頭發(fā)絲的十分之一還小，更別說(shuō)組成細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等等。因此，想要看清楚蛋白質(zhì)等分子的結(jié)構(gòu)，依靠傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡是無(wú)法做到的。

隨著20世紀(jì)物理學(xué)的不斷發(fā)展，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)電子也是一種波。當(dāng)電子束照射到某一個(gè)物體上時(shí)，電子會(huì)像光子一樣攜帶物體的形狀信息，并繼續(xù)向前傳播。又由于電子在磁場(chǎng)下會(huì)發(fā)生偏轉(zhuǎn)，所以我們可以用磁場(chǎng)做出像放大鏡一樣的透鏡系統(tǒng)。有了這兩方面的理論準(zhǔn)備，電子顯微鏡應(yīng)運(yùn)而生。由于電子的波長(zhǎng)遠(yuǎn)小于光子的波長(zhǎng)，電子顯微鏡的理論分辨率極限也遠(yuǎn)超光學(xué)顯微鏡的分辨率。在材料領(lǐng)域中，電子顯微鏡甚至可以觀測(cè)到原子之間的排布。

盡管電子顯微鏡的放大能力無(wú)比強(qiáng)大，但并不是只要將細(xì)胞放在顯微鏡下就能看清楚里面的細(xì)節(jié)。由于電子很容易受空氣中的灰塵或者空氣分子本身的影響，電子顯微鏡的內(nèi)腔需要維持在近真空下。而在真空中，細(xì)胞里面的水分子會(huì)瞬間沸騰氣化（液體的沸點(diǎn)會(huì)隨著氣壓的下降而下降），細(xì)胞也將隨之煙消云散。所以，我們需要首先將細(xì)胞或者其他生物樣本在極低的溫度下瞬間冷凍，鎖住它們?cè)谀且豢痰臓顟B(tài)，然后才能在冷凍電鏡下進(jìn)行觀察。這也是冷凍電子顯微鏡成像（cryo－electron microscopy，簡(jiǎn)稱cryo－EM）中“冷凍”（cryo－）兩個(gè)字的由來(lái)。

除了需要冷凍以外，生物樣品在冷凍電鏡領(lǐng)域的應(yīng)用還受到另外一個(gè)重要限制，那就是樣品并不能經(jīng)受過(guò)多的電子輻照。過(guò)多的電子輻照會(huì)破壞蛋白結(jié)構(gòu)，給冷凍狀態(tài)下的樣品造成局部受熱并引發(fā)膨脹，甚至可能會(huì)融化玻璃態(tài)的冰。因此，我們用冷凍電鏡觀測(cè)生物樣品時(shí)，只能使用較低的電子劑量。但這就好比在漆黑的夜晚，不使用閃光燈就給人拍照，獲得的照片將是模糊的。與之類似，使用冷凍電鏡對(duì)生物樣品進(jìn)行單次拍照，信噪比也非常低。當(dāng)然，科學(xué)家也有應(yīng)對(duì)之道：首先純化我們感興趣的蛋白質(zhì)，然后把溶解了成千上萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)分子的溶液極速冷凍后放在電鏡里拍照。這時(shí)就可以獲得幾十萬(wàn)顆這種蛋白質(zhì)的照片，并且每個(gè)蛋白質(zhì)的方向各不相同，相當(dāng)于對(duì)同一個(gè)蛋白質(zhì)拍了幾十萬(wàn)張不同的投影照片。將這些照片的信號(hào)疊加在一起，我們就能夠提高信噪比，獲得這個(gè)蛋白質(zhì)的高清三維結(jié)構(gòu)。這種方法也就是冷凍電鏡單顆粒成像技術(shù)SPA（Single particle analysis）。

圖1． 使用冷凍電鏡解析的正二十面體型病毒的結(jié)構(gòu)比較［1］。

斷層成像：與其他結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段互補(bǔ)

隨著直接探測(cè)電子相機(jī)（DDD camera）的出現(xiàn)和新算法的開(kāi)發(fā)，冷凍電鏡在2013年迎來(lái)一場(chǎng)分辨率革命（resolution revolusion），并逐漸成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的主要研究方法。七年過(guò)去了，冷凍電鏡單顆粒技術(shù)解析的高分辨率蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)如雨后春筍般顯現(xiàn)，極大地豐富了人們對(duì)蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)知。

與日漸成熟的冷凍電鏡單顆粒技術(shù)一道，冷凍電鏡斷層成像技術(shù)cryo－ET（cryo－electron tomography）和子斷層圖像平均法STA（sub－tomogram average）也正在悄然崛起，將結(jié)構(gòu)生物學(xué)引導(dǎo)向解析柔性超大分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)、細(xì)胞原位蛋白結(jié)構(gòu)等方向，應(yīng)用范圍覆蓋蛋白復(fù)合物、病毒、細(xì)菌、細(xì)胞甚至組織，分辨率最高已達(dá)3? ［2］，是名副其實(shí)的跨尺度高分辨顯微成像利器。

cryo－ET被應(yīng)用在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中，可以回答很多獨(dú)一無(wú)二的生物學(xué)問(wèn)題，在筆者看來(lái)最吸引人的有四個(gè)：1）它帶來(lái)豐富的、納米級(jí)分辨率的生物背景 （context） 。比如生物大分子在原生環(huán)境中的拷貝數(shù)、分布規(guī)律、與其他分子的互作；2）它展示天然原位的生物結(jié)構(gòu)；3）它的三維原始數(shù)據(jù)特點(diǎn)為解析柔性超大分子復(fù)合物帶來(lái)可能；4）結(jié)合光電聯(lián)合、聚焦離子束減薄等技術(shù)，它可以實(shí)現(xiàn)跨尺度高分辨成像，甚至可以從生物組織中獲得納米級(jí)分辨率三維信息。實(shí)際上，目前結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域積攢了太多只有cryo－ET才能回答的問(wèn)題。由于應(yīng)用前景廣闊，可拓展空間巨大，cryo－ET被譽(yù)為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的未來(lái)技術(shù)方向。

圖2． cryo－ET是一種高分辨、跨尺度的原位顯微成像方法，應(yīng)用面非常廣闊（圖：李賽）

那么cryo－ET的原理是什么呢？

首先，cryo－ET的“T”和在醫(yī)院里做的CT（computerized tomography，意為“電子計(jì)算機(jī)斷層掃描”）的“T”是同一事物，都是“斷層”的意思，二者的三維成像原理也很類似。在醫(yī)院做CT檢查，掃描儀器會(huì)繞著身體旋轉(zhuǎn)并進(jìn)行拍攝。而對(duì)于cryo－ET來(lái)說(shuō)，需要旋轉(zhuǎn)樣品而不是電鏡。通過(guò)旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái)，我們可以對(duì)樣品進(jìn)行不同角度的拍攝，一般是在－60°到＋60°的范圍內(nèi)。

圖3． CT、ET、EM的比較（圖片來(lái)自Joachim Frank書籍） 從－60°到正60°，每隔3°對(duì)樣品拍一張照，共可得到41張平面照片。這41 張照片足以構(gòu)建樣品的三維信息嗎？從二維投影到三維圖像的重構(gòu)原理是什么？分辨率的限制是什么？這些關(guān)于cryo－ET的基礎(chǔ)的思考誘發(fā)了幾個(gè)重要理論的建立，它們奠定了cryo－ET技術(shù)的理論基礎(chǔ)，是后人細(xì)化技術(shù)革新的理論堅(jiān)石。

01 中心截面定理

中心截面定理是指，一個(gè)物體在某一方向上投影的傅里葉變換，等于該物體三維傅里葉變換中過(guò)中心的與投影方向垂直的截面。

根據(jù)中心截面定理，我們拍攝41張不同角度的照片，對(duì)這些照片做傅里葉變換，就能夠得到這個(gè)物體三維傅里葉空間里41張截面的信息。我們?cè)賹?duì)這個(gè)被信息填充的三維傅里葉空間做逆變換，就能夠獲得該圖像的三維形狀。因而，我們可以通過(guò)cryo－ET技術(shù)獲得細(xì)胞或者蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。

圖4． 中心截面定理的示意圖，三維的兔子被投影成二維照片后做傅里葉變換，與三維兔子直接做傅里葉變換后垂直投影方向的截面是一樣的。（圖片來(lái)自于牛津大學(xué)cryo－ET workshop課件）

圖5． cryo－ET成像示意圖。（a）FEG表示電子槍，用于發(fā)射電子。CCD camera相機(jī)用于采集照片。光路下的樣品被一邊旋轉(zhuǎn)一邊拍攝；（b）表示對(duì)同一個(gè)物體進(jìn)行了不同角度的拍攝；（c）代表通過(guò)這些不同角度的照片重構(gòu)出物體原本的結(jié)構(gòu)（Gruenewald et al．， 1993）。

02 克勞瑟準(zhǔn)則

細(xì)心的讀者朋友也許發(fā)現(xiàn)了，41張照片遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以填充連續(xù)的三維傅里葉空間，只能夠離散地對(duì)其做出不完整的填充。并且由于低電子劑量拍照的原因，每一個(gè)角度的照片都有著很高的噪音。其實(shí)，在cryo－ET技術(shù)發(fā)展的早期，科學(xué)家們已經(jīng)對(duì)cryo－ET成像的潛力進(jìn)行了物理與數(shù)學(xué)上的分析。劍橋分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（MRC－LMB）的結(jié)構(gòu)病毒學(xué)家Tony Crowther等人在1969年分析了對(duì)于一定尺寸的物體，至少需要多少不同角度照片才能將其結(jié)構(gòu)重構(gòu)到一定分辨率，并提出了一項(xiàng)準(zhǔn)則：克勞瑟準(zhǔn)則 Crowther criterion ［3］。

克勞瑟準(zhǔn)則的公示表達(dá)是：N＝πD／d。其中，D和d分別代表了樣品的尺寸以及想要達(dá)到的分辨率，N是想要獲得目標(biāo)分辨率至少需要拍攝的傾轉(zhuǎn)照片數(shù)量。例如，當(dāng)樣品是直徑100nm的病毒，而我們想要獲得的分辨率是10nm的話，那么我們所需要拍攝的不同角度數(shù)大約是31張。當(dāng)然，克勞瑟準(zhǔn)則的推導(dǎo)需要很多前提條件，但它提出的概念仍具有極強(qiáng)的指導(dǎo)意義：即使電鏡拍攝的不同角度照片數(shù)量有限，我們?nèi)钥梢垣@得納米分辨率級(jí)別的三維結(jié)構(gòu)信息。這表明冷凍電鏡斷層成像這一技術(shù)是具有研發(fā)和應(yīng)用的前景的。

03 電子劑量分配定理

1976年，位于德國(guó)慕尼黑附近的馬克斯普朗克生物化學(xué)所的Walter Hoppe （2017年諾獎(jiǎng)得主Joachim Frank的博士導(dǎo)師） 又提出了關(guān)于電子劑量分配的定理Dose fractionation theorem［4］：假設(shè)使用同樣的電子劑量拍照，把這些劑量平均分配給多個(gè)角度的照片（假設(shè)可以完美地對(duì)齊這些照片），那么相比于用該劑量一次性給單個(gè)角度拍照，從這些傾轉(zhuǎn)照片獲得的三維信息將更好。

簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)，這意味著盡管cryo－ET的每個(gè)單張照片可能信噪比較低，但重構(gòu)成三維圖像后，信號(hào)可以加強(qiáng)，并且理論上信號(hào)質(zhì)量可以超過(guò)單次高劑量投影相片。

圖6． 按照解決生物問(wèn)題的不同，ET技術(shù)方向有多種層次的細(xì)分（圖：李賽） 有了這些理論上可行性的分析和鋪墊，cryo－ET技術(shù)在后來(lái)40多年的發(fā)展中被應(yīng)用到蛋白復(fù)合物、病毒、細(xì)菌、細(xì)胞甚至組織等跨尺度高分辨成像中，在技術(shù)上不斷細(xì)分并不斷完善。

STA：原子級(jí)別的分辨率

了解單顆粒技術(shù)（SPA）的讀者朋友也許會(huì)疑問(wèn)，在使用單顆粒技術(shù)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)時(shí)，往往需要對(duì)幾十萬(wàn)顆同種蛋白質(zhì)進(jìn)行拍攝，才能夠填補(bǔ)傅里葉空間，獲得高分辨率的結(jié)構(gòu)。那么cryo－ET中有類似的方法嗎？答案是肯定的。

在cryo－ET收集的數(shù)據(jù)中，可能也會(huì)出現(xiàn)高度重復(fù)的同一種蛋白或者更大的復(fù)合體。例如新冠病毒原位全病毒結(jié)構(gòu)［5］，每套cryo－ET數(shù)據(jù)都包含了10多顆完整的新冠病毒，平均每顆新冠病毒的表面分布著30個(gè)刺突蛋白。既然這些刺突蛋白是同一種蛋白質(zhì)，并且大量重復(fù)出現(xiàn)，就可以將其所在的子斷層圖像（sub－tomogram）裁剪出來(lái)，并旋轉(zhuǎn)到同一個(gè)方向，把所有的該蛋白質(zhì)的信號(hào)疊加起來(lái)，這樣就可以獲得一個(gè)高信號(hào)、低噪音的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，這也就是STA的原理。

圖7． 子斷層平均法的示意圖。Cryo－ET獲得的斷層成像中，相同蛋白所在的子斷層被裁剪出來(lái)，并對(duì)齊到同一方向。這時(shí)，將所有子斷層的信號(hào)進(jìn)行疊加就能獲得高信噪比的三維重構(gòu)［6］。

由于刺突蛋白在原始三維數(shù)據(jù)中的準(zhǔn)確坐標(biāo)已經(jīng)確定，因此在解出蛋白結(jié)構(gòu)后，可以將其投射回去。通過(guò)這種方法，研究者從2300顆新冠病毒的cryo－ET數(shù)據(jù)中計(jì)算出最高達(dá)7．8?分辨率的刺突結(jié)構(gòu)，以及13?的核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）結(jié)構(gòu)，并投射重構(gòu)出一個(gè)具有代表性的新冠病毒全病毒結(jié)構(gòu)。

圖8． 新冠病毒斷層圖像截面，疊加在原始數(shù)據(jù)上的使用STA重構(gòu)的完整病毒結(jié)構(gòu)，以及刺突蛋白最高達(dá)7．8?分辨率的結(jié)構(gòu)［5］

讀到這里，讀者朋友們可能會(huì)感覺(jué)：子斷層平均法STA與單顆粒技術(shù)SPA的原理很像，都是將同一種蛋白質(zhì)的信號(hào)大量疊加在一起來(lái)提升信噪比，事實(shí)上也確實(shí)如此。當(dāng)然，子斷層平均法目前的分辨率還比不過(guò)單顆粒技術(shù)，原因有很多，可能是拍照效率不夠高、拍照過(guò)程中樣品抖動(dòng)、生物樣品受到電子輻照損傷等等。

單顆粒技術(shù)每次只需要拍一張照片，這個(gè)過(guò)程可能只需要半分鐘，而使用斷層成像時(shí)，則要傾轉(zhuǎn)樣品，又要保持傾轉(zhuǎn)的過(guò)程中樣品不被挪出拍照視野，所以一套cryo－ET的數(shù)據(jù)采集相對(duì)費(fèi)時(shí)，大約需要半小時(shí)。這樣一來(lái)，使用cryo－ET方法很難獲得像單顆粒方法一樣多的數(shù)據(jù)。數(shù)量上不去，最終的分辨率自然受到限制。

另外，電鏡的機(jī)械裝置在傾轉(zhuǎn)樣品時(shí)，難免會(huì)導(dǎo)致樣品的前后位置對(duì)應(yīng)不起來(lái)。這就好比在拍CT時(shí)，盡管醫(yī)生交代了需要保持靜止，患者卻左右晃動(dòng)。這會(huì)造成最終重構(gòu)出的結(jié)構(gòu)像拍攝奔跑的運(yùn)動(dòng)員一樣帶著糊影。最后，過(guò)多電子的照射會(huì)使生物樣品所在的冰層發(fā)生形變，這和樣品的抖動(dòng)一樣，也會(huì)造成分辨率的下降。

以上這些限制cryo－ET分辨率的因素，造成了目前大多數(shù)cryo－ET和STA應(yīng)用所獲得的分辨率一直停留在4?以外。在2015年，被廣泛使用的單顆粒重構(gòu)軟件Relion的研究團(tuán)隊(duì)在Structure雜志上發(fā)文，把Relion的算法應(yīng)用到了STA上［7］。作者在論文中明確指出，電子輻照產(chǎn)生的樣品移動(dòng)是限制STA分辨率的重要因素。具體來(lái)說(shuō)，不同角度之間的樣品移動(dòng)只能通過(guò)金顆粒進(jìn)行校正，其準(zhǔn)確性是不足的。

但科學(xué)家們一直在不斷努力打破分辨率的極限。2018年，牛津大學(xué)章佩君團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了emClarity軟件，首次實(shí)現(xiàn)了以樣品顆粒為基準(zhǔn)來(lái)校準(zhǔn)不同角度之間樣品的移動(dòng)，并通過(guò)循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)校準(zhǔn)，獲得了3．1?的核糖體（體外提純樣品）STA結(jié)構(gòu)［8］。

今年，位于德國(guó)哥廷根的馬克斯普朗克生物物理化學(xué)研究所Patrick Cramer團(tuán)隊(duì)的Dimitry Tegunov等人開(kāi)發(fā)了M軟件［10］。結(jié)合使用M及他們之前開(kāi)發(fā)的Wrap軟件［9］，能對(duì)電子產(chǎn)生的樣品移動(dòng)及冰層形變進(jìn)行更為精確的校準(zhǔn)。這一算法成功地將細(xì)胞切片的cryo－ET數(shù)據(jù)中的核糖體解析到了3．7?的分辨率，并清晰地展示了其中的抗生素電子密度。這一令人震驚的結(jié)果預(yù)示著cryo－ET和STA的高分辨時(shí)代也許即將到來(lái)。在不久的將來(lái)，也許我們可以將原位的蛋白結(jié)構(gòu)廣泛地解析到近原子分辨率，使用cryo－ET來(lái)獲得蛋白質(zhì)的原子模型將成為可能。而在這背后作為支撐的，則是越來(lái)越穩(wěn)定高效的電鏡硬件，性能越來(lái)越高的計(jì)算機(jī)，以及考慮越來(lái)越精細(xì)的算法。

囊膜病毒的“照妖鏡”

在冷凍電鏡結(jié)構(gòu)病毒學(xué)的發(fā)展過(guò)程中，加州大學(xué)圣地亞哥分校的Timothy Baker和牛津粒子成像中心的首屆主任Stephen Fuller起著奠基者的作用。Baker堅(jiān)持研究以正二十面體型為主的無(wú)囊膜病毒 （nonenveloped virus），而Fuller則選擇了對(duì)人類健康威脅更大的囊膜病毒 （enveloped virus）。無(wú)囊膜病毒沒(méi)有囊膜，直接由蛋白質(zhì)外殼包裹，其范疇較廣，從動(dòng)物病毒、噬菌體、到水生病毒等都有。囊膜病毒的外圍則有脂質(zhì)雙層膜包裹，侵?jǐn)_人類的天花、乙肝、艾滋、狂犬、流感、寨卡等病毒，均是囊膜病毒。

雖然都是病毒，但針對(duì)兩者的研究手段有很大的區(qū)別。無(wú)囊膜病毒大多數(shù)就像一個(gè)模子刻出來(lái)的，典型的結(jié)構(gòu)是正二十面體組裝（圖1），其結(jié)構(gòu)解析主要使用冷凍電鏡成像技術(shù)cryo－EM及單顆粒重構(gòu)方法SPA。而絕大多數(shù)囊膜病毒組裝松散，柔性極大，高分辨率重構(gòu)整顆囊膜病毒的唯一方法，就是采用冷凍電鏡斷層成像技術(shù)cryo－ET和子斷層圖像平均法STA。 為了解析囊膜病毒結(jié)構(gòu)，F(xiàn)uller從此邁入cryo－ET這個(gè)在當(dāng)時(shí)異常年輕的領(lǐng)域。

圖9． 使用冷凍電鏡斷層成像和子斷層圖像平均法解析的囊膜病毒比較。自左至右：新冠病毒、裂谷熱病毒、漢坦病毒、拉沙病毒、流感病毒、鹽生多形型病毒（來(lái)源：李賽實(shí)驗(yàn)室及李賽項(xiàng)目圖片）

2000年，F(xiàn)uller辭去海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL Heidelberg）主任一職，搬到有多年結(jié)構(gòu)病毒學(xué)傳統(tǒng)的牛津大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)部，并在那里與學(xué)部主任David Stuart（饒子和院士的博士后導(dǎo)師）聯(lián)手建立了牛津粒子成像中心，并任第一屆主任。他主持建成了集成高端冷凍電鏡設(shè)施的BSL－3（生物安全三級(jí)）實(shí)驗(yàn)室，并在那里開(kāi)展艾滋病毒HIV的成像及結(jié)構(gòu)工作。至今，全世界同一級(jí)別、功能類似的實(shí)驗(yàn)室僅有兩家，另一家在美國(guó)德克薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院 （UTMB），主要從事病原微生物的鑒定、病原－宿主相互作用及結(jié)構(gòu)解析等方面的研究。

肆虐全球的新冠病毒（SARS－CoV－2）亦屬于囊膜病毒。2020年，在新冠病毒基因序列公布之后的3個(gè)月內(nèi)，重組表達(dá)的刺突蛋白、核蛋白的局部結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析出來(lái)了。然而，病毒的完整結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)蛋白在病毒上的原位全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)、分布規(guī)律、拷貝數(shù)及與其他結(jié)構(gòu)蛋白的互相關(guān)系仍是謎團(tuán)。

如果能盡快將病毒的形象真實(shí)、完整、清晰地呈現(xiàn)給世界，也許就能讓更多人對(duì)病毒有直觀認(rèn)識(shí)，對(duì)疫情防治重視起來(lái)。今年八九月間，Nature ［11］、Science ［12］、Cell ［5］雜志分別報(bào)道了英國(guó)劍橋、德國(guó)馬普所、清華大學(xué)的研究人員解析新冠病毒原位結(jié)構(gòu)的研究。眾多網(wǎng)友紛紛評(píng)論：“病毒長(zhǎng)得很瘆人”“毛骨悚然”“一看就不好惹”“為新冠病毒張貼了高清的通緝照”……可見(jiàn)完整真實(shí)的病毒形象的確帶來(lái)了視覺(jué)沖擊，起到了警示作用。

圖10． 真實(shí)的新冠病毒全病毒結(jié)構(gòu)［5］。

冠狀病毒的“皇冠”特征，來(lái)源于病毒表面凸起的刺突蛋白（spike protein）。它就像一把“鑰匙”，讓新冠病毒識(shí)別出細(xì)胞表面的受體，并與之結(jié)合，介導(dǎo)膜融合，最終侵入細(xì)胞。目前大多數(shù)疫苗和抗體的研發(fā)都聚焦于刺突蛋白。在全病毒結(jié)構(gòu)解析的過(guò)程中，研究人員發(fā)現(xiàn)，相比于其他囊膜病毒，新冠病毒的刺突蛋白有三個(gè)獨(dú)特的地方：

（1）在病毒表面分布隨機(jī)，且拷貝數(shù)較少（平均約30個(gè)），僅為拉沙病毒及流感病毒的1／5－1／10；

（2）靠近病毒囊膜的莖部區(qū)柔性較大，使得刺突蛋白在病毒表面能夠近乎自由地旋轉(zhuǎn)，甚至可能游走，就像古代的武器“鏈錘”一樣。因此新冠病毒在侵染細(xì)胞時(shí)，能夠自由調(diào)整刺突蛋白的方位，方便和單個(gè)、甚至多個(gè)受體結(jié)合，這可能是新冠病毒高傳染性的原因之一；

（3）刺突蛋白在病毒表面可呈現(xiàn)兩種狀態(tài)：其中97％處于“融合前狀態(tài)”（prefusion），3％處于“融合后狀態(tài)”（postfusion），只有后者才能和ACE2受體結(jié)合。一般而言，刺突蛋白只有受到pH值變化、受體結(jié)合等因子觸發(fā)才會(huì)向融合后狀態(tài)轉(zhuǎn)變，而新冠病毒帶有疑似“自發(fā)”的融合后狀態(tài)。這種狀態(tài)的刺突蛋白已經(jīng)缺失了其S1亞基，剩下的S2亞基已經(jīng)發(fā)生較大的形變，也許能“欺騙性”地誘導(dǎo)出一些抗體，但這種抗體可能無(wú)法中和正常的病毒。

除了解析病毒表面的刺突蛋白結(jié)構(gòu)，清華大學(xué)的研究人員還在仔細(xì)查看新冠病毒的斷層圖像過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)病毒體內(nèi)塞滿了空心珠子一樣的東西，而且這些珠子似乎有著排列規(guī)則。在貼近病毒囊膜上下表面的地方，有時(shí)可以看見(jiàn)這些珠子排列成清晰的六邊形。經(jīng)驗(yàn)表明，這些珠子可能就是核糖核蛋白復(fù)合物RNP，而且它們是有多個(gè)層次結(jié)構(gòu)的。

圖11． 新冠病毒體內(nèi)有很多珠子一樣的物質(zhì)，而且它們隱約有排列規(guī)律。標(biāo)尺為50納米（圖：李賽）

經(jīng)過(guò)挑選和分析，研究人員展示出，新冠病毒腔內(nèi)的RNP像串珠一樣將RNA組織在一起，并在病毒體內(nèi)呈現(xiàn)六聚“鳥巢”型和正四面體“金字塔”型兩種局部排列，有序地收納了長(zhǎng)長(zhǎng)的RNA鏈條，還增加了病毒在復(fù)雜環(huán)境中經(jīng)受物理挑戰(zhàn)的能力。這可能是世界范圍內(nèi)首次“看清”正義單鏈RNA病毒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

以上三篇解析新冠病毒全病毒結(jié)構(gòu)的文章實(shí)際都得益于Stephen Fuller早年種下的大樹。Nature一文的通訊作者John Briggs是Fuller的博士生；Science一文的第一作者Beata Turnova是John Briggs的博士生；Cell一文的通訊作者李賽在牛津粒子成像中心做了5年博后／副研，可算是Fuller的第三代弟子。令人痛惜的是，F(xiàn)uller因健康原因56歲便退休，60歲時(shí)便英年早逝（2014年）了。他雖未能親眼目睹冷凍電鏡在后來(lái)突飛猛進(jìn)的技術(shù)革命，但他創(chuàng)始的囊膜病毒結(jié)構(gòu)學(xué)及參與奠基的cryo－ET技術(shù)現(xiàn)在已是遍地開(kāi)花。愿以此文紀(jì)念Fuller教授。

圖12．（左）牛津大學(xué)粒子成像中心創(chuàng)始人之一Stephen Fuller教授及其團(tuán)隊(duì)的自畫像；（右）該中心BSL－3級(jí)冷凍電鏡實(shí)驗(yàn)室內(nèi)景。（來(lái)源：李賽）

參考文獻(xiàn)

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作者介紹：李賽從事冷凍電鏡斷層成像技術(shù)開(kāi)發(fā)及囊膜病毒的結(jié)構(gòu)研究。2009－2012年，他在德國(guó)哥廷根大學(xué)物理學(xué)院從事流感病毒組裝機(jī)制研究，并獲得博士學(xué)位；2012－2018年，在牛津大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)部的BSL－3級(jí)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)及使用cryo－ET方法，并研究了拉沙病毒、裂谷熱病毒、漢坦病毒及嗜鹽古菌多形病毒的高分辨結(jié)構(gòu)；2018年入職清華大學(xué)生命學(xué)院并建立獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室，開(kāi)展了冠狀病毒、艾滋病毒等研究。在過(guò)去12年的囊膜病毒研究中，他較為系統(tǒng)地研究了新發(fā)致病型囊膜病毒的組裝，及通過(guò)膜融合去組裝的原位結(jié)構(gòu)與機(jī)制，并希望找到病毒的弱點(diǎn)。為解答這些問(wèn)題，他一直深耕于高分辨率 cryo－ET方法的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用。他的工作發(fā)表在Cell、Cell Research、Nature Communications、Cell Reports、PLoS Pathogens等刊物上。