通過ESTIMATE算法計算免疫，間質(zhì)和ESTIMATE得分，并以此篩選DEGs，進行生存分析、KEGG、GO、GSEA分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并篩選hub基因，最后通過構(gòu)建風(fēng)險評分（RS）模型，研究hub基因的預(yù)后價值并用驗證集進行驗證。

題目：從TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選對急性髓系白血病有預(yù)后價值的基因

一．研究背景

急性髓系白血�。ˋML）是一種造血克隆性惡性腫瘤。AML患者的治療和預(yù)后取決于準(zhǔn)確的細胞遺傳學(xué)和基因檢測。AML疾病狀況的改善主要得益于支持療法和造血細胞移植的進步。然而，由于高復(fù)發(fā)率，AML的5年生存率仍然很低，因此迫切需要新穎有效的治療方法。從免疫治療的角度出發(fā)，希望找到與AML的腫瘤微環(huán)境相關(guān)的具有預(yù)后價值的基因。

二．分析流程

三．結(jié)果解讀

1．?dāng)?shù)據(jù)收集與處理

收集了TCGA中三級AML患者的轉(zhuǎn)錄組資料，即入選的樣本在樣本ID中以＂－03＂結(jié)尾，屬于＂原發(fā)性血源癌－外周血＂。一共入選了173例樣本。使用GDC工具提取樣本的臨床特征和生存數(shù)據(jù)，使用limma包進行歸一化處理。

2． 免疫評分與癌癥和急性白血病B組（CALGB）細胞遺傳學(xué)風(fēng)險類別和生存結(jié)果相關(guān)

使用ESTIMATE算法分別計算樣本的免疫評分、基質(zhì)評分和ESTIMATE評分。繪制箱線圖，觀察上述評分與CALGB細胞遺傳學(xué)風(fēng)險類別的關(guān)系。

免疫評分越高與CALGB細胞遺傳學(xué)風(fēng)險類別的風(fēng)險等級越高相關(guān)（P＝0．0396，圖1A）。

基質(zhì)評分和ESTIMATE評分未觀察到與CALGB細胞遺傳學(xué)風(fēng)險類別之間的顯著性（分別為P ＝ 0．8585和P ＝ 0．3320，圖1B，C）。

根據(jù)免疫評分、基質(zhì)評分和ESTIMATE評分的中位數(shù)分別將AML樣本分為高分組和低分組，繪制生存曲線，評估這三個評分與總體生存率之間的關(guān)系。

免疫評分和ESTIMATE評分越高，總體生存情況越差（分別為P＝0．0224，P＝0．0195，圖1D，F(xiàn)）。

基質(zhì)評分的不同水平與總體生存率之間無顯著關(guān)系（P＝0．3676，圖1E）。

圖1 免疫評分、基質(zhì)評分、ESTIMATE評分在CALGB細胞遺傳學(xué)風(fēng)險類別中的分布情況箱線圖以及生存曲線

3．AML中基于免疫評分和基質(zhì)評分的表達譜比較

將免疫評分和基質(zhì)評分按中位數(shù)分為高組和低組，分別繪制基因表達熱圖（圖2A，圖3A）。并根據(jù)免疫評分和基質(zhì)評分的高低組分別篩選DEGs（PFDR ＜ 0．05 ， ｜log2FC｜ ＞ 1），繪制火山圖（圖2B，圖3B）。通過Venn圖對兩組獲得的DEGs取交集。

在免疫評分組中篩選了331個上調(diào)的DEGs和889個下調(diào)的DEGs。

在基質(zhì)評分組中篩選了195個上調(diào)的DEG和870個下調(diào)的DEGs。

在Venn圖中，篩選出147個有交集的上調(diào)基因（圖2C）和680個有交集的下調(diào)基因（圖2D）。

圖2 基于免疫評分分組的表達譜熱圖、火山圖以及Venn圖

圖3 基于基質(zhì)評分分組的表達譜熱圖、火山圖

4．功能富集分析

對上一步得到的有交集的DEGs進行GO和KEGG富集分析。結(jié)果顯示這些DEGs和免疫反應(yīng)存在顯著關(guān)聯(lián)。

GO分析主要富集于炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細胞膜、受體活性。圖4A，B，C分別展示了生物過程、細胞成分和分子功能的前10個條目。

在KEGG通路注釋（圖4D）和富集分析（圖4E）中，主要是與免疫、癌癥和結(jié)核病相關(guān)的通路。通路富集分析的前20條結(jié)果如圖4F所示。

圖4 GO和KEGG分析結(jié)果

5．PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以及hub基因篩選

使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了包含786個節(jié)點和1774條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape的cytoHubba插件來識別hub基因，從12種算法中選擇了前10個節(jié)點，并排除了degree＜10的基因。最后，確定了18個TME相關(guān)的hub基因：ITGAL、ITGAM、HLA－DRB1、HLA－DRB5、FPR1、CX3CR1、TNFRSF1B、CXCL16、CTSB、CTSS、HLA－DRA、P2RY13、ITGB2、CEACAM3、SLC11A1、C5AR1、ADORA3和GNGT2。

圖5 cytoHubba插件基于12種算法進行hub基因識別

6．GSEA分析

隨后進行GSEA分析，并設(shè)置FDR＜0．25、｜enriched score｜＞ 0．35、基因集內(nèi)基因數(shù)≥35。

GSEA的結(jié)果表明：抗原加工和呈遞，B細胞受體信號傳導(dǎo)通路，趨化因子信號傳導(dǎo)通路，F(xiàn)cγR介導(dǎo)的吞噬作用，移植物與宿主疾病，造血細胞譜系，產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)，NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性，NOD樣受體信號傳導(dǎo)通路，T細胞受體信號傳導(dǎo)通路和Toll樣受體信號傳導(dǎo)通路是腫瘤免疫相關(guān)交叉基因富集的主要通路（圖6）。

圖6 GSEA分析的結(jié)果

7．風(fēng)險評分和生存分析

基于多變量Cox回歸分析，計算出每個AML患者的風(fēng)險評分（RS）公式。

RS ＝ ITGAL ＊ 0．177 ＋ ITGAM ＊ 0．315 ＋ HLA－DRB1 ＊ 0．371 ＋ HLA－DRB5 ＊ （?0．009） ＋ FPR1 ＊ 0．034 ＋ CX3CR1 ＊ （?0．074） ＋ TNFRSF1B ＊ 0．172 ＋ CXCL16 ＊ （?0．104） ＋ CTSB ＊ （?0．38） ＋ CTSS ＊ （?0．201） ＋ HLA－DRA ＊ （?0．353） ＋ P2RY13 ＊ 0．003 ＋ ITGB2 ＊ 0．038 ＋ CEACAM3 ＊ （?0．051） ＋ SLC11A1 ＊ （?0．034） ＋ C5AR1 ＊ （?0．049） ＋ ADORA3 ＊ 0．213 ＋ GNGT2 ＊ 0．208

隨后根據(jù)中位數(shù)將163例AML患者分為低RS組和高RS組，進行生存分析，研究不同RS水平與總體生存率之間的關(guān)系。結(jié)果表明，高RS與不良的總生存期有關(guān)（圖7A）。然后繪制ROC曲線，并計算曲線下面積AUC為0．725，顯示出RS對總體生存率的預(yù)測準(zhǔn)確性較高（圖7B）。

圖7 RS的預(yù)后價值

此外，還繪制了18個hub基因的生存曲線，以探討預(yù)后價值（圖8）。結(jié)果顯示，hub基因的高表達水平與不良的總體生存率有關(guān)。

圖8 18個hub基因的K－M曲線

8．Vizome數(shù)據(jù)庫分析

Vizome是最大的AML數(shù)據(jù)庫，它包含了從562名患者收集的672份腫瘤樣本的全外顯子組測序數(shù)據(jù)。驗證了Vizome數(shù)據(jù)庫中hub基因的表達水平。熱圖顯示，18個hub基因在數(shù)據(jù)庫中的樣本中表現(xiàn)出高表達（圖9A）。圖9B中還顯示了其中4個hub基因的相互作用關(guān)系。

圖9 驗證Vizome數(shù)據(jù)庫中hub基因的表達水平

小結(jié)

       利用TCGA數(shù)據(jù)庫，基于ESTIMATE算法得出的免疫評分和基質(zhì)評分得到了可預(yù)測AML患者預(yù)后不良的TME相關(guān)基因，并對其進行對進行功能富集分析。構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選得到TME相關(guān)的hub基因，并構(gòu)建RS模型，為預(yù)測AML患者的生存狀況提供了新的依據(jù)。