前言

過繼性免疫治療是血液學(xué)的一種變革性治療方法,它通過基因工程在T細(xì)胞表達(dá)合成嵌合抗原受體(CAR)。針對 B 細(xì)胞白血病和淋巴瘤中的 CD19 抗原的 CAR-T 細(xì)胞已得到臨床認(rèn)可,目前成為全球范圍癌癥中心實施的“常規(guī)” 治療手段。

CAR結(jié)構(gòu)由三部分組成:細(xì)胞外抗原識別結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和含有CD3ζ或共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。CAR-T細(xì)胞具有誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫抗CAR應(yīng)答的潛力,這些免疫應(yīng)答是針對CAR的非自身成分或源自基因轉(zhuǎn)移載體的殘余蛋白,這些蛋白具有固有的免疫原性。

這種免疫反應(yīng)可能會限制CAR-T細(xì)胞得療效。目前臨床開發(fā)中的許多CAR的單鏈抗體來自小鼠或其他非人類抗體。雖然到目前為止,還沒有確鑿的證據(jù)表明這種抗CAR免疫反應(yīng)會導(dǎo)致其他不良反應(yīng),如細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)和免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征(ICANS),但是已有證據(jù)表明,CAR或載體殘留蛋白特異性的T細(xì)胞會清除和滅活注入的CAR-T細(xì)胞。同樣,體液免疫產(chǎn)生的CAR中和抗體也會促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的凋亡。

因此,隨著CAR-T技術(shù)的進(jìn)展,在提高療效和持久性的同時,了解CAR-T細(xì)胞免疫原性的起源和機制仍非常關(guān)鍵,尤其是在實體瘤患者。

抗CAR免疫的臨床證據(jù)

在已獲批上市的CAR-T產(chǎn)品中,Kymirah和Yescarta都觀察到了已存在的體液免疫。在臨床試驗中,接受Kymirah的絕大多數(shù)B-ALL患者(84．6%,n=88)有預(yù)先存在的抗CAR抗體,在難治性彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的患者中比例高達(dá)91．4%。相比而言,在接受Yescarta治療的患者中,預(yù)先存在的抗CAR抗體就少的多(3%,n=94)。但是總體而言,這些存在的抗CAR抗體的患者并沒有表現(xiàn)出更差的臨床結(jié)果,CD19靶向CAR的抗抗體似乎不會損害初始的臨床反應(yīng)。

然而與預(yù)先存在的抗體相比,輸注后出現(xiàn)的CAR特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞可能與一些臨床試驗的治療失敗有關(guān)。在第一代自體CD19 CAR-T細(xì)胞的劑量遞增試驗中,首次報道了這種細(xì)胞免疫情況。兩名患者在第一次輸注(108個細(xì)胞/m2)24小時后雖然都檢測到了CAR-T細(xì)胞,但它們無法持續(xù)存在,甚至不到1周。盡管以更高劑量再輸注并使用IL-2支持,CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)仍不能存活。這種失敗可能在一定程度上是制造方法的原因,但在第一次輸注前存在的T細(xì)胞介導(dǎo)的抗CAR反應(yīng)可能會加劇這種結(jié)果。

盡管一些血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者在首次輸注CD19 CAR-T細(xì)胞的完全緩解率很高,但疾病復(fù)發(fā)仍然是一個問題,大約30-50%的患者在12個月內(nèi)復(fù)發(fā)。對于這些復(fù)發(fā)的患者,重復(fù)輸注是一種很有吸引力的選擇。然而,第二次或隨后輸注的臨床反應(yīng)一般都不理想,通常只有<25%的患者出現(xiàn)完全緩解。隨后的患者的亞組分析中,觀察到了CAR特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的擴(kuò)增,這種細(xì)胞與重復(fù)輸注后CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增減少有關(guān)。

此外,針對除CD19外的其它靶點的CAR-T細(xì)胞和新一代的CAR-T細(xì)胞,都發(fā)現(xiàn)了存在針對CAR-T細(xì)胞的體液和細(xì)胞免疫,可能與不良的臨床結(jié)果相關(guān)。

降低固有的CAR免疫原性

CAR結(jié)構(gòu)的幾個組成部分有可能觸發(fā)患者的抗CAR免疫反應(yīng)�？梢允褂酶鞣N方法降低這些成分的免疫原性。

人源化腫瘤反應(yīng)性單鏈抗體

一些研究人員正在開發(fā)和測試人源化單鏈抗體,以規(guī)避與小鼠源性單鏈抗體相關(guān)的抗CAR反應(yīng)。人源化后的免疫原性可能較低,并且對于初次輸注小鼠來源的CAR-T細(xì)胞后疾病復(fù)發(fā)的患者或未經(jīng)CAR-T細(xì)胞治療的患者是一種不錯的選擇。

另一種策略是用缺乏輕鏈和潛在免疫原性連接序列的重鏈抗體。2019年11月報告了BCMA特異性全人重鏈抗體CAR-T的首個臨床結(jié)果。然而從理論上講,全人源抗體仍然可以在患者中引發(fā)涉及抗獨特型抗體的免疫反應(yīng),因此,直接比較小鼠源性和人源化單鏈抗體免疫原性的頭對頭臨床試驗是有必要的。

腫瘤特異性結(jié)構(gòu)域

除了基于單鏈抗體的CARs,腫瘤細(xì)胞也可以通過內(nèi)源性腫瘤特異性受體-配體相互作用作為靶點。CAR的scFv部分可以被受體的胞外區(qū)或與受體結(jié)合的配體所取代。目前正在進(jìn)行臨床前和早期臨床評估的這種CAR結(jié)構(gòu)包括嵌合NKG2D受體,IL-13、整合素αvβ6結(jié)合肽和heregulin-ζ chimaeras。然而,到目前為止,還沒有關(guān)于使用這種通用受體策略的免疫原性數(shù)據(jù)。

CAR間隔區(qū)突變

scFv與靶抗原表位的最佳結(jié)合對于有效的CAR-T細(xì)胞治療至關(guān)重要,尤其是靠近腫瘤細(xì)胞膜的近端表位可能需要具有更長和更靈活鉸鏈結(jié)構(gòu)域的CAR-T細(xì)胞。許多研究小組使用了各種IgG重鏈的恒定區(qū)作為間隔,然而重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域可被固有免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和NK細(xì)胞)上的Fc受體靶向,并可能造成免疫原性風(fēng)險。這種情況可以通過突變間隔區(qū)內(nèi)的Fc受體結(jié)合表位來避免,從而阻止先天免疫細(xì)胞活化。

新型CAR技術(shù)的免疫原性

細(xì)胞因子

CAR添加細(xì)胞因子旨在提高CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效果,特別是為了克服免疫抑制微環(huán)境,如IL-15。然而,細(xì)胞因子的應(yīng)用,可能增加患者免疫原反應(yīng)的風(fēng)險,并可引起諸如發(fā)熱、寒戰(zhàn)、低血壓、血小板減少和淋巴細(xì)胞減少等毒性反應(yīng)。

旁觀者T細(xì)胞活化是這種旁分泌細(xì)胞因子支持策略固有的理論風(fēng)險,盡管旁分泌細(xì)胞因子是否能放大任何抗CAR反應(yīng)仍有待進(jìn)一步研究。相應(yīng)地,通過改造CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞因子受體或受體胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域可僅向CAR-T細(xì)胞提供免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號,而不影響旁觀者淋巴細(xì)胞,這種策略目前正在臨床試驗中進(jìn)行研究(NCT035332和NCT0499997)。

自殺基因與清除標(biāo)記

盡管對某些血液惡性腫瘤患者有效,但由于靶向非腫瘤毒性以及附加技術(shù)帶來的不可預(yù)測的不良影響,使CAR-T細(xì)胞治療面臨著很多安全風(fēng)險。

在CAR-T細(xì)胞中加入自殺基因和清除標(biāo)記是一種減少嚴(yán)重不良事件的有效手段,可以控制CAR-T細(xì)胞的定向清除。然而,這種方法也存在著免疫原性反應(yīng)的風(fēng)險。例如,在表達(dá)HSV-TK作為自殺基因的T細(xì)胞中鑒定出多個免疫原表位,從而導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗CAR-T細(xì)胞反應(yīng)。

由人類來源的蛋白(如截短的EGFR或iCaspase 9自殺系統(tǒng))改造的清除標(biāo)記同樣也可能增加免疫原性的風(fēng)險。為在CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品中實現(xiàn)安全基因,許多研究人員選擇將2A序列與CAR共表達(dá),最近,包括基因編輯也被用來創(chuàng)建無轉(zhuǎn)基因的自殺開關(guān),這些方法相關(guān)免疫原性的風(fēng)險都需要進(jìn)一步的研究。

基因編輯

基因編輯增強CAR-T細(xì)胞的功能是目前熱門的研究領(lǐng)域,如通過基因敲除破壞內(nèi)源性免疫檢查點蛋白的表達(dá),從而提高CAR-T細(xì)胞的性能。此外,基因編輯也可用于通過消除細(xì)胞表面MHC的表達(dá)來逃避T細(xì)胞介導(dǎo)的抗CAR免疫,用于同種異體CAR-T細(xì)胞。

基因編輯除了要避免脫靶效應(yīng)意外,由CRISPR–Cas9系統(tǒng)引起的免疫原性相關(guān)風(fēng)險,也可能導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的Cas9表達(dá)細(xì)胞的清除。然而,臨床研究顯示,瞬時CRISPR–Cas9遞送系統(tǒng)并未影響異源TCR重定向T細(xì)胞的持久存在。因此,與組成性過度表達(dá)相反,瞬時表達(dá)可能是CAR-T細(xì)胞基因編輯的首選方法,值得進(jìn)一步研究。

異基因CAR-T細(xì)胞的免疫原性

使用健康捐贈者的細(xì)胞制作現(xiàn)成的同種異體CAR-T細(xì)胞是一種非常有吸引力的方法,可能擴(kuò)大這些細(xì)胞的臨床適用性,確保及時可用性。然而,在這些CAR-T細(xì)胞上表達(dá)的非自身MHCs可能引起宿主源性的免疫反應(yīng),導(dǎo)致免疫介導(dǎo)的細(xì)胞清除。

異基因CAR-T細(xì)胞可被患者的對外來主要MHC抗原具有特異反應(yīng)性的T細(xì)胞靶向。即使是部分HLA匹配的供體,也可能由于多態(tài)性引起的微小抗原差異產(chǎn)生額外的免疫原性。

有幾種方法被用來產(chǎn)生MHC抗原表達(dá)減少的CAR-T細(xì)胞,從而使患者的治療不受HLA差異的影響。

通過直接編輯HLA位點或破壞B2M基因編碼,有可能阻止CD8+T細(xì)胞的同種異體排斥反應(yīng)。然而,由于T細(xì)胞活化引起MHCⅡ的上調(diào),同種特異性CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞排斥反應(yīng)也可能發(fā)生。通過敲除MHCⅡ基因的主要轉(zhuǎn)錄因子CIITA來消除MHCⅡ的表達(dá),可以減輕這種排斥。

這些方法對T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)有一定的抑制作用,然而,矛盾的是,HLA分子的丟失使得異基因CAR-T細(xì)胞也容易被NK細(xì)胞殺傷。因此,人們開發(fā)出NK細(xì)胞抑制轉(zhuǎn)基因來促進(jìn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在免疫活性宿主中的持久性。例如,Gornalusse等人通過在人類多能干細(xì)胞中表達(dá)融合到B2M和誘餌抗原的非多態(tài)性HLA-E分子,開發(fā)出對CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的排斥具有抵抗力的細(xì)胞。其他策略還包括多重基因編輯、CD47過表達(dá)以及一種“同種免疫防御受體”的方法。

此外,廣泛的淋巴耗竭也可以降低立即發(fā)生同種異體排斥的風(fēng)險。但是,這種方法可能由于持續(xù)的同種異體CAR-T細(xì)胞增殖而導(dǎo)致移植物抗宿主病(GvHD)的可能性。為了降低GvHD的風(fēng)險,研究人員選擇將CAR轉(zhuǎn)移到病毒特異性T細(xì)胞中,從而產(chǎn)生更安全的產(chǎn)品,因為此類細(xì)胞的TCR不太可能具有同種異體反應(yīng)。

小結(jié)

CAR-T細(xì)胞是目前治療某些復(fù)發(fā)和/或難治性惡性血液病的重要手段。然而,CAR-T細(xì)胞具有免疫原性,可能影響CAR-T細(xì)胞治療的效果。雖然在血液瘤中,通過清除內(nèi)源性B細(xì)胞可以降低對CAR-T細(xì)胞免疫應(yīng)答的風(fēng)險,然而,針對非B細(xì)胞惡性腫瘤(如實體瘤)的CAR-T細(xì)胞可誘導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞反應(yīng),從而增加免疫原性的風(fēng)險。

此外,開發(fā)提高CAR-T細(xì)胞安全性和/或功能性的技術(shù),如自殺基因或細(xì)胞因子,也可能帶來新的免疫原性風(fēng)險,異基因供體來源的CAR-T細(xì)胞的出現(xiàn)和發(fā)展同樣引起了人們對免疫原性問題的關(guān)注。

現(xiàn)有的策略,通過替換人源化單鏈抗體或其他免疫原性較弱成分的CAR可能降低抗CAR免疫的風(fēng)險,在臨床上,加強淋巴耗竭對于減輕抗CAR免疫反應(yīng)和促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的持久性仍然至關(guān)重要。

因此,有必要在臨床前和臨床研究中納入CAR相關(guān)免疫原性分析,以便對免疫原性反應(yīng)及其影響進(jìn)行詳細(xì)研究,以確保CAR-T細(xì)胞在癌癥患者治療中的安全性和有效性。這些信息也會增加我們對免疫原性臨床相關(guān)性的理解,并為未來CAR-T細(xì)胞策略的發(fā)展提供幫助。