前言

臨床成功的ADCs的設計不僅取決于有效載荷的效力及其附著點、連接子的穩(wěn)定性和有效的藥物釋放，而且還取決于抗體和生物偶聯(lián)技術(shù)的選擇。在過去10年中，所有經(jīng)FDA批準的ADC都是以ADC的異構(gòu)混合物的形式存在，單抗的不同位置上附著著不同數(shù)量的藥物。偶聯(lián)位點對ADC穩(wěn)定性及其藥代動力學具有顯著的影響，高DAR（藥物抗體比）常常導致血漿清除迅速，而低DAR的ADC則表現(xiàn)出的活性較弱。在ADC的藥物中，裸單抗的存在是一種有效的競爭抑制劑。因此，在過去十年中，人們開發(fā)了一大批新的偶聯(lián)策略，目的是控制小分子藥物的位置和數(shù)量，同時保持結(jié)構(gòu)完整性和同質(zhì)性。

基于化學的特異性原位抗體修飾

單克隆抗體的天然結(jié)構(gòu)為生物偶聯(lián)提供了多種可能性，基于化學的、特異性的天然（非工程）抗體偶聯(lián)具有一些優(yōu)點。它可以避免抗體特定位點突變的復雜性，以及在細胞培養(yǎng)的放大和優(yōu)化方面可能面臨的挑戰(zhàn)。

偶聯(lián)位點根據(jù)抗體序列，賴氨酸、組氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等內(nèi)源性氨基酸在二硫鍵間的連接位點非常具有吸引力。所有經(jīng)FDA批準的ADC，直到2021年，都利用這些內(nèi)源性氨基酸進行偶聯(lián)。然而，抗體支架還包含聚糖，這是在單克隆抗體生產(chǎn)過程中，F(xiàn)C區(qū)域的翻譯后修飾所導致的。一些研究報告了糖工程化的新策略，這似乎是一種有趣的生物偶聯(lián)替代方法。

與內(nèi)源性氨基酸的偶聯(lián)

最常見的偶聯(lián)方法之一是利用抗體的賴氨酸殘基，氨基酸親核NH2基團與利克有效載荷上親電的N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）基團發(fā)生反應。盡管反應簡單，但可利用賴氨酸殘基的高豐度導致了許多ADC在隨機分布下的不均勻混合物的形成。DAR受藥物／抗體化學計量比的控制，該方法得到廣泛應用，包括已獲批的ADC，如Besponsa， Mylotarg， 和Kadcyla。

最近，同樣也報道了對賴氨酸位點和殘基的特異性修飾。通過計算機輔助設計，磺酰丙烯酸酯被用作中間試劑，用于在天然蛋白質(zhì)序列上對單個賴氨酸殘基進行修飾。

反應的區(qū)域選擇性歸咎于磺酰丙烯酸酯的設計以及每個賴氨酸周圍獨特的局部微環(huán)境。通過計算預測，pKa最低的賴氨酸容易以位點特異性的方式在弱堿性pH下優(yōu)先反應。即使在其他親核殘基如半胱氨酸存在的情況下也觀察到了這種反應。該技術(shù)已應用于5種不同的蛋白質(zhì)和曲妥珠單抗，在偶聯(lián)后均保留了原有的二級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能。

2018年，Rai等人報告了另一種利用“化學關(guān)鍵蛋白”的可逆分子間反應進行的位點特異性修飾。該試劑攜帶多種官能團，這些官能團在所有可獲得的賴氨酸殘基上可逆地形成亞胺部分。然后，關(guān)鍵蛋白通過試劑中的環(huán)氧化物與近端組氨酸殘基反應。因此，在生理條件下，關(guān)鍵蛋白從賴氨酸中分離，醛被再生，從而能夠通過肟結(jié)合標記抗體。

這種關(guān)鍵蛋白的定向修飾技術(shù)后來發(fā)展成單賴氨酸殘基標記技術(shù)，即使在存在N－末端胺的情況下也具有毋庸置疑的選擇性。方法的成功依賴于Fk1－間隔子－Fk2試劑。

Fk1官能團與賴氨酸可逆反應，調(diào)節(jié)Fk2近端賴氨酸部分的微環(huán)境。然后通過酰胺鍵在Fk2處的賴氨酸殘基（K169和K395）進行偶聯(lián)，間隔子的設計調(diào)節(jié)偶聯(lián)的位置。該方法已成功應用于ADC（trastuzumab－emtansine）的合成，證明其細胞活性與已獲批準的Kadcyla相當。

Merlul等人最近報道了一種不同的結(jié)合策略，有效地靶向天然抗體上的組氨酸殘基。他們引入了一種基于陽離子有機金屬鉑（II）的連接子，［乙二胺鉑（II）］2＋，圖中表示為Lx。

這種技術(shù)基于絡合和偶聯(lián)兩個步驟。氮雜環(huán)配體如哌啶與Lx配位形成絡合物前體，穩(wěn)定的中間體包含有效載荷和配體上的一個氯離子。該復合物含有帶正電荷的Pt（II）中心，這提高了連接子和有效載荷復合物的水溶性并最小化抗體聚集，該方法還擴展到類似的碘絡合物。在最近的一份報告中，碘化鈉的使用被證明可以顯著提高該技術(shù)的偶聯(lián)產(chǎn)率和選擇性。Cl－Lx－藥物載荷絡合物上殘留的氯配基與碘化物的交換生成更具活性的I－Lx－藥物載荷，從而獲得更高的偶聯(lián)產(chǎn)率。這項技術(shù)已被應用于ADC藥物的大規(guī)模生產(chǎn)。

二硫化物重橋接策略

IgG抗體包含四個鏈間二硫鍵，兩個連接輕鏈和重鏈，兩個位于連接兩條重鏈的鉸鏈區(qū)，它們維持著單克隆抗體的完整性。另一個經(jīng)典的生物偶聯(lián)途徑探索了這些半胱氨酸作為有效載荷連接點的作用。四個二硫鍵的還原通常會產(chǎn)生八個巰基，它們能夠與馬來酰亞胺的連接子反應，從而產(chǎn)生DAR為8的ADC。

Doronina及其同事報告了嵌合抗CD30單克隆抗體偶聯(lián)MMAE，DAR＝8的 ADC實例。與經(jīng)典的賴氨酸偶聯(lián)相比，這種有效載荷加載方式得到了更好的控制。然而，據(jù)報道，較高的藥物負荷會增加聚集的風險，從而導致高血漿清除率，并降低體內(nèi)療效。

Badescu和al在2014年報告了一種新的位點特異性重橋接偶聯(lián)策略，他們是第一個證明新的雙砜（bis－sulfone）能夠烷基化來自抗體和抗體片段中還原二硫鍵的兩個巰基，對抗原結(jié)合的影響最小。后來，Wang和al描述了一種新的水溶性烯丙砜（allyl sulfone），該試劑在沒有原位活化的情況下提高了反應活性。它表現(xiàn)出高穩(wěn)定性、高水溶性和位點特異性。

此外，還有巰基炔與末端炔烴和環(huán)辛炔生物偶聯(lián)的再橋接技術(shù)，其進一步發(fā)展出新一代馬來酰亞胺，如二溴－（DBM）和二硫代馬來酰亞胺（DTM），用于位點特異性偶聯(lián)。這些馬來酰亞胺類似物在第3位和第4位含有良好的脫離基團，從而實現(xiàn)快速、高效和高產(chǎn)率的偶聯(lián)。最近報道了結(jié)合二溴和二硫代馬來酰亞胺性質(zhì)的雜化硫代溴馬來酰亞胺（TBM），這種TBM試劑結(jié)合更快，顯示出更高的DAR＝4的百分比，這可能是由于溴減少了空間位阻。

2015年，Chudasama等人引入了一類新的重橋接試劑，二溴吡啶二酮（dibromopyridazinediones）。他們證明了它能有效地插入到二硫鍵中，得到的結(jié)構(gòu)即使在高溫下也表現(xiàn)出了極好的水解穩(wěn)定性。然而，隨著還原步驟上的溫度升高，也觀察到不均一性，這種結(jié)構(gòu)也允許選擇性地引入不同的功能基團。

二乙烯基嘧啶（Divinylpyrimidine）是另一種有效的重橋接試劑，能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的DAR＝4的ADC。Spring等人研究了乙烯基雜芳基支架對半胱氨酸再橋接的作用，他們認為用嘧啶取代吡啶可以使雜芳環(huán)成為更好的電子受體，從而提高交聯(lián)效率。他們的工作擴展到二乙烯基三嗪，在高溫下，重橋接顯示出更高的效率。

為了避免與經(jīng)典馬來酰亞胺偶聯(lián)相關(guān)的體內(nèi)不穩(wěn)定性的缺點，Barbas等人研究了甲基磺�；�苯基惡二唑，該試劑對半胱氨酸具有特異性反應。與血漿中的半胱氨酸－馬來酰亞胺偶聯(lián)物相比，他們的穩(wěn)定性更高。受此啟發(fā)，Zeglis設計了DiPODS試劑，該試劑含有兩個通過苯基連接的惡二唑基甲基砜部分， DiPODS以重橋接的方式與兩個硫酸根形成共價鍵。與馬來酰亞胺偶聯(lián)相比，以這種方式偶聯(lián)具有優(yōu)越的體外穩(wěn)定性和體內(nèi)性能。

聚糖偶聯(lián)

由于IgG是一種糖蛋白，它在Fc片段每個重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域N297位置包含一個N－聚糖，這種糖基化可以作為連接有效載荷的附著點。多糖與Fab區(qū)域間遠距離定位降低了在偶聯(lián)后損害抗體的抗原結(jié)合能力的風險，此外，與抗體的肽鏈相比，它們的化學組成不同，允許位點特異性修飾，使它們成為合適的偶聯(lián)位點。

聚糖生物偶聯(lián)可根據(jù)用于靶向碳水化合物的技術(shù)來區(qū)分：包括聚糖代謝工程化、聚糖氧化后的糖轉(zhuǎn)移酶處理、內(nèi)糖苷酶和轉(zhuǎn)移酶處理后的酮或疊氮化物標記。

Neri等人報道了在IgG抗體的N－糖基化位點處巖藻糖的位點特異性修飾。這種糖含有一個順式二醇部分，適合選擇性氧化。他們用偏高碘酸鈉氧化巖藻糖殘基，生成一個能夠與含聯(lián)氨的連接子反應的醛基，這樣，抗體通過腙鍵與藥物相連。

Senter及其同事向細胞培養(yǎng)基中添加硫基類似物，通過代謝將6－硫代巖藻糖帶入抗體修飾。他們認為，取代是通過劫持巖藻糖基化途徑來完成的，這樣就引入了化學位點來實現(xiàn)位點特異性結(jié)合。與經(jīng)典半胱氨酸偶聯(lián)物相比，這種方法顯著降低了異質(zhì)性水平，并產(chǎn)生具有更可預測的藥動學和藥效學特性的偶聯(lián)物。

重組IgG中很少含有唾液酸，然而，已經(jīng)證明，利用半乳糖基和唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以酶法改造甘氨酸。通過酶反應添加半乳糖以獲得G2聚糖，然后添加末端唾液酸。這種修飾通過高碘酸氧化生成醛基，可以偶聯(lián)帶羥胺基團的連接子－有效載荷。所得的偶聯(lián)物具有較高的靶向選擇性，體內(nèi)抗腫瘤活性良好。高碘酸還可氧化蛋氨酸等敏感氨基酸，影響與FcRn的結(jié)合。

除這些偶聯(lián)策略外，半乳糖殘基也可以作為修飾位點。多項研究報告了通過使用突變的β－ 1，4－半乳糖轉(zhuǎn)移酶，將半乳糖替換為一種含酮或疊氮官能團的半乳糖，這種具有雙正交官能團的半乳糖衍生物為高效偶聯(lián)開辟了途徑。這些技術(shù)已被開發(fā)用于成像和抗癌應用。

從化膿性鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)糖苷酶EndoS和EndoS2，這些酶能夠水解IgG的N－聚糖，從而使水解后的殘基成為生物偶聯(lián)的有效位點。這種方法有助于使單抗的聚糖結(jié)構(gòu)均勻化，同時它也適用于任何IgG亞型。此類方法應用于trastuzumab－maytansine，制備出具有良好體外和體內(nèi)藥效的糖偶聯(lián)ADC。

工程化抗體的位點特異性生物偶聯(lián)

生物正交化學和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的進展有助于產(chǎn)生更均勻的ADC。盡管在天然單抗上有許多可用的附著方法可供選擇，但在工程化抗體上的位點特異性生物偶聯(lián)能夠更有效地控制DAR，并且避免改變與抗原結(jié)合的親和力。這樣，在某些位置加入天然或非天然氨基酸，得到具有優(yōu)良藥代動力學和藥效學特征的同質(zhì)產(chǎn)品。

酶法

有效載荷的附著可以通過在抗體序列中插入特定的氨基酸標簽以非常有選擇性的方式實現(xiàn)。這些標簽被特定的酶所識別，例如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（MTG）、轉(zhuǎn)肽酶或酪氨酸酶，從而能夠執(zhí)行位點特異性偶聯(lián)。

Aaron等人探索了一種新的利用醛標記蛋白質(zhì)的位點特異性偶聯(lián)。該技術(shù)利用了基因編碼的五肽序列（Cys－X－Pro－X－Arg），其中半胱氨酸殘基被FGE識別，并在細胞中蛋白質(zhì)表達期間被共翻譯氧化為甲酰甘氨酸。這樣，工程化抗體通過HIPS（hydrazino－Pictet–Spengler）化學方法與醛特異性連接子選擇性偶聯(lián)。

微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（MTGase）策略也經(jīng)常被開發(fā)用于定位特異性偶聯(lián)。MTGase催化在脫糖抗體295位置的谷氨酰胺側(cè)鏈與底物的伯胺之間形成肽鍵。與其他酶策略相比，MTG是一種靈活的技術(shù)，不需要肽供體來實現(xiàn)偶聯(lián)。只要�；�受體含有一種伯胺，就沒有結(jié)構(gòu)限制。

谷氨酰胺殘基自然存在于單抗的每個重鏈的Fc區(qū)域。在295位去糖基化后，谷氨酰胺殘基通過MTGase介導的反應偶聯(lián)，可以產(chǎn)生均一的DAR＝2的ADC。為了提高效率，可以偶聯(lián)帶支鏈的連接子，從而使DAR翻倍，297位的天冬酰胺突變?yōu)楣劝滨０芬部稍黾覦AR。

NBE Therapeutics開發(fā)了基于S金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)肽酶A介導的偶聯(lián)。他們的策略利用轉(zhuǎn)肽酶A（SrtA），在LPXTG（X＝任何氨基酸）五肽的基序中切割蘇氨酸和甘氨酸殘基之間的酰胺鍵。然后，它催化甘氨酸相關(guān)的有效載荷與新生成的C－末端的偶聯(lián)，在生理溫度和pH下生成肽鍵。

該方法應用于不同抗體，如抗CD30和抗Her2，并使用含有5甘氨酸標記的連接子偶聯(lián)maytansine和MMAE，兩種ADC均顯示出與經(jīng)典偶聯(lián)相似的體外細胞殺傷活性。酶法產(chǎn)生的trastuzumab－maytansine在體內(nèi)試驗中完全匹配Kadcyla。

在另一個例子中，利用轉(zhuǎn)肽酶法生成了高效蒽環(huán)素毒素衍生物PNU－159682的ADC。有趣的是，通過這項技術(shù)，偶聯(lián)效率甚至高于Adcetris和Kadcyla類似物。此外，所制備的PNU－159682 ADC具有較高的體外和體內(nèi)穩(wěn)定性，并且顯示出的效力超過了含有微管蛋白靶向有效載荷的ADC。

另一個新興的新方法是通過酪氨酸標簽進行位點特異性抗體標記，酪氨酸標簽與單克隆抗體輕鏈的C末端基因融合�？紤]到位點可及性，Bruins及其同事使用了一種工程化的四甘氨酰酪氨酸殘基作為標記，它為偶聯(lián)提供了一個容易觸及的位點。酪氨酸酶將酪氨酸氧化成1，2－醌，從而允許與各種雙環(huán)［6．1．0］壬炔（BCN）衍生物的環(huán)加成反應。這種方法可以與含有BCN連接子的MMAE有效地偶聯(lián)。

半胱氨酸工程：硫單抗技術(shù)

隨機半胱氨酸偶聯(lián)和重橋接是利用抗體結(jié)構(gòu)內(nèi)天然存在的半胱氨酸殘基的技術(shù)。然而，隨機半胱氨酸方法的異質(zhì)性以及重橋接策略中的單抗片段化需要在ADC合成中加以考慮，特別是當疏水性藥物被偶聯(lián)時。

與它們不同的是，硫單抗技術(shù)通過利用不涉及結(jié)構(gòu)二硫鍵的工程化反應性半胱氨酸，在抗體上實現(xiàn)所需位點的選擇性和均勻修飾。一般來說，半胱氨酸突變的設計是為了促進細胞毒性有效載荷偶聯(lián)的同時，保持單克隆抗體的穩(wěn)定性、親和力和最小化ADC聚集。為了確定突變的最佳位置，通常采用幾種技術(shù)，包括計算建模、模型系統(tǒng)篩選和高通量掃描。

Junutula等人首先報道了一種硫單抗策略，用工程化半胱氨酸殘基取代了抗MUC16抗體重鏈114位的丙氨酸（HC－A114），工程化位置內(nèi)的反應性硫醇能夠與馬來酰亞胺負載的連接子反應。合成的抗MUC16 ADC在異種移植小鼠模型中表現(xiàn)出效力，在大鼠和食蟹猴中表現(xiàn)出高劑量耐受性，這個發(fā)現(xiàn)建立了硫單抗偶聯(lián)策略的一般性方法。

此外，琥珀酰亞胺連接在胞漿內(nèi)可以經(jīng)歷兩個平行反應：反向Michael反應導致連接子－有效載荷的損失，以及琥珀酰亞胺的水解，這兩種反應都對體內(nèi)ADC活性有顯著影響。為了提高穩(wěn)定性，Lyon和合作者設計了一個與馬來酰亞胺相鄰的堿性氨基整合進來的連接子。在連接子中加入二氨基丙酸（DPR）促進了硫琥珀酰亞胺在中性pH和室溫下的快速定量水解，這樣，非特異性的去偶聯(lián)作用被阻止，從而提高了體內(nèi)的穩(wěn)定性。除了常用的馬來酰亞胺外，還探索了不同的半胱氨酸反應劑，如碘乙酰胺、溴甲酰胺、羰基丙烯酸酯，N－烷基乙烯基吡啶鹽。

與工程化非天然氨基酸的生物偶聯(lián)

除了硫單抗技術(shù)外，非標準氨基酸（ncAA）的加入為位點特異性偶聯(lián)提供了另一種可能性。該技術(shù)使用含有獨特化學結(jié)構(gòu)的氨基酸，從而能夠以化學選擇性的方式引入連接子－有效載荷復合物。該技術(shù)需要對抗體序列重組，利用與宿主細胞內(nèi)所有內(nèi)源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶（aaRS），用于響應未賦值密碼子將ncAA帶入蛋白質(zhì)。通常，ncAA在發(fā)酵過程中被添加到培養(yǎng)基中。選擇非天然氨基酸是很重要的，因為它們可能激發(fā)免疫原性。常用的ncAA是具有獨特基團的天然氨基酸的類似物，如酮、疊氮、環(huán)丙烯或二烯。

已有研究將對乙酰苯丙氨酸（pAcF）成功地整合入抗CXCR4 抗體中。有效載荷Auristin通過肟連接與抗體有效偶聯(lián)，從而生成化學均一的ADC。該ADC在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的體外活性和完全清除肺腫瘤的作用。

由于肟連接所需的酸性條件和ADC緩慢釋放的動力學，另一種選擇是加入含ncAA的疊氮化物。廣泛應用的對疊氮哌苯胺（pAzF）可在生理條件下快速進行CuAAC或SPAAC反應，利用這種策略成功地在抗CD74抗體上偶聯(lián)糖皮質(zhì)激素有效載荷。除了pAcF技術(shù)外，還成功地將含疊氮的賴氨酸類似物（AzK）帶入到抗體中，以產(chǎn)生具有Auristin、PBD二聚體或微管蛋白有效載荷的位點特異性ADC。

此外，賴氨酸的環(huán)丙烯衍生物（CypK）以及自然發(fā)生的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）都成功地整合進入抗體中。所產(chǎn)生的ADC表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性、選擇性以及體外和體內(nèi)活性。

ADC的臨床開發(fā)概況

目前，ADC藥物開發(fā)領(lǐng)域持續(xù)火熱，有效載荷，連接子和偶聯(lián)技術(shù)的快速發(fā)展使ADC具有更高的均勻性、穩(wěn)定性和生成效率。這為臨床上的ADC藥物開發(fā)提供了燃料，下面3個表格按照“小分子、生物大分子和放射性同位素”的分類總結(jié)了截至2021年2月處于臨床開發(fā)后期中的ADC。

小結(jié)

盡管第一個ADC在20多年前就獲得了FDA的首次批準，但制藥行業(yè)必須經(jīng)歷一個漫長且乏味的學習過程，才能在市場和臨床開發(fā)中獲得一條穩(wěn)定的ADC管線。得益于技術(shù)的進步，我們在有效載荷，連接子和偶聯(lián)技術(shù)方面獲得了多個突破，進一步加深了對ADC這種新型藥物的全面認識，但是將這些知識如何轉(zhuǎn)化為更安全和更有效的ADC藥物，仍然有很多需要學習和探索的地方。希望最近的3篇總結(jié)能夠為大家提供一點點幫助。

參考文獻：

1．The Chemistry Behind ADCs． Pharmaceuticals （Basel）． 2021 May； 14（5）： 442．