概述  

迄今為止,與傳統(tǒng)的抗癌治療策略相比,免疫治療被認為是最有前景的全身性腫瘤治療方法,在提高治療效果方面發(fā)揮著不可或缺的作用,尤其是對難治性癌癥的治療。新興的癌癥免疫療法包括癌癥疫苗、嵌合抗原受體的T細胞(CAR-T)治療、細胞因子治療、免疫檢查點抑制劑和腫瘤靶向單克隆抗體(mAbs)。其中,單克隆抗體因其特異性靶向分子的能力,已成為癌癥治療中一種關(guān)鍵和有效的治療方式。然而,由于腫瘤復雜的疾病發(fā)病機制,針對單一靶點的單克隆抗體往往不足以表現(xiàn)出足夠的治療效果。因此,針對多個靶點的雙特異性抗體(bsAbs)應運而生,它的發(fā)展改變了腫瘤免疫治療的領(lǐng)域。

由于能夠同時針對腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境(TME)中的兩個表位,bsAbs逐漸被成為下一代治療性抗體的一個重要和富有前景的組成部分。目前正在開發(fā)的大多數(shù)bsAbs被設(shè)計成通過將免疫細胞,特別是細胞毒性T細胞,與腫瘤細胞緊密相連,從而形成一個人工免疫接觸,最終導致靶向腫瘤細胞的選擇性攻擊和裂解。雖然存在多種bsAb形式,但根據(jù)FC片段的存在與否,可將其大致分為兩類:IgG樣和非IgG樣。Fc片段的存在顯著地發(fā)揮了額外的效應器功能。目前,許多臨床前和臨床試驗正在進行中。然而, bsAb藥物在腫瘤治療中的應用仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn),包括腫瘤異質(zhì)性和突變負荷、難以控制的腫瘤微環(huán)境、激活T細胞的共刺激信號不足、持續(xù)注射的必要性、致命的全身副作用和脫靶的毒性作用。針對這些問題,本文提出了多種策略來解決這些問題,包括制備多特異性bsAb、發(fā)現(xiàn)新抗原、將bsAb與其他抗癌藥物結(jié)合、開發(fā)基于NK細胞的bsAb和原位制備bsAb。

bsAb的設(shè)計策略

bsAb通過同時結(jié)合不同的抗原或表位而表現(xiàn)出雙重特異性,它們在腫瘤治療領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注,主要有四種作用:(a)重新定向特異性免疫效應細胞,選擇性地破壞癌細胞;(b)靶向多種細胞表面抗原,從而提高靶向特異性;(c)向腫瘤內(nèi)輸送藥物;以及(d)通過阻斷兩種生物學途徑來提高治療效力和持久性。在這些功能中,最常用的一種功能是使免疫效應細胞靠近癌細胞,從而降低全身毒性,規(guī)避耐藥性,bsAb大致分為兩組:(a)IgG樣(有Fc區(qū))和(b)非IgG樣(無Fc區(qū))。

具有Fc區(qū)的IgG樣bsAb由于其較大的尺寸和FcRn介導的再循環(huán)過程,比沒有Fc區(qū)域的bsAb具有更長的循環(huán)半衰期。純化更方便,溶解度和穩(wěn)定性提高。更重要的是,它可能具有更大的臨床治療潛力,以保留多種Fc介導的效應器功能,包括抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)和Ab依賴性細胞吞噬作用。

非IgG樣bsAb片段相比之下,顯示出相對較低的循環(huán)動力學,但具有更好的組織穿透能力,較低的免疫原性,以及較低的固有免疫系統(tǒng)的非特異性激活。這種形式的bsAb主要依賴于其抗原結(jié)合能力發(fā)揮多種功能。

為了延長非IgG樣結(jié)構(gòu)的半衰期,同時保持其原有的生物活性、安全性和低免疫原性,可采用多種策略來增加其分子量并延長其在血清中的半衰期:(a)用肽接頭使Ab片段形成多聚體;(b)與其他分子如人血清白蛋白、聚乙二醇(PEG)、碳水化合物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)和葡聚糖偶聯(lián)。Ab片段的多聚化,以多聚單鏈抗體為例,是非IgG類似形式的核心策略。

bsAb技術(shù)平臺的發(fā)展歷史  

bsAb的歷史可以追溯到1961年,當時Nisonoff和Rivers首次提出通過混合不同的Ab片段來產(chǎn)生多特異性Abs的概念。在雜交瘤技術(shù)和化學重組方法分別于1975年和1985年建立的早期階段,BSAb的產(chǎn)生依賴于雜交瘤體細胞融合產(chǎn)生四瘤體或兩個不同單抗的F(ab′)2分子的化學異共軛。然而,因為化學偶聯(lián)可能使bsAb失活、展開或聚集,bsAb的進一步發(fā)展受到阻礙。同時,四元體技術(shù)常常錯誤地組裝重鏈和輕鏈,從而導致所需配對的產(chǎn)率降低,并產(chǎn)生意想不到的免疫反應。從本質(zhì)上講,正確的重鏈-輕鏈配對通常包括兩個方面:(a)兩個不同的重鏈的正確配對;(b)輕鏈與相應的正確重鏈相結(jié)合。這些問題迫切需要改進方法來產(chǎn)生正確配對的bsAb。最初,重鏈/輕鏈的錯配問題是在1995年通過創(chuàng)造一個嵌合的鼠/鼠源四聯(lián)體來解決的,這保證了同源重鏈的正確配對。例如,臨床批準的catumaxomab由小鼠IgG2a抗CD3半抗原與大鼠IgG2b抗上皮細胞粘附分子(EpCAM)半抗原組成。1998年,相同的輕鏈配對兩個重鏈的應用也顯示出了效果。然而,重鏈錯配和免疫原性仍然存在,臨床應用范圍有限,需要更好的解決方案。

迅速發(fā)展的基因工程技術(shù)為克服上述缺點提供了機會,這促進了第二波bsAb的開發(fā)。這些新開發(fā)的bsAb的生產(chǎn)主要依靠重組DNA技術(shù),在控制bsAb的大小、親和力、雙特異性、半衰期、穩(wěn)定性、溶解度和生物分布等屬性的同時,能夠產(chǎn)生嵌合或人源化的抗體,以滿足所需目標產(chǎn)品的不同需求。1996年,Ridgway等人描述了利用CH3結(jié)構(gòu)域突變產(chǎn)生人源化抗CD3×CD4雜交的“knobs into holes”(KiH)方法。這種方法是通過在bsAb的一個重鏈中用一個小的氨基酸替換大的氨基酸(hole),在bsAb的另一個重鏈(knob)中反之,最終根據(jù)靜電導向理論引導形成異源二聚體而不是同源二聚體。利用噬菌體展示技術(shù)篩選出形成穩(wěn)定異二聚體的CH3突變體。此外,為了減少單體或同源二聚體雜質(zhì),一些研究人員進一步設(shè)計重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域,以添加鏈間二硫鍵,進一步提高異二聚體并提供純化的可能性。該技術(shù)還可通過將肽、蛋白質(zhì)配體或Ab片段融合到Fc鏈的兩端來產(chǎn)生各種類型的異二聚體蛋白質(zhì)。之后,稱為CrossMab的新技術(shù)的出現(xiàn)進一步減少了重鏈/輕鏈配對的副產(chǎn)物。這是通過在一個Abs的Fab區(qū)內(nèi)交換重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)的,從而導致VH-VL和CH1-CL之間界面的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,以完整的Fc和抗原結(jié)合域構(gòu)建了抗血管生成素-2和血管內(nèi)皮生長因子a的CrossMab-bsAb,其穩(wěn)定性和親和力均高于其親本抗體。CrossMab形式可進一步分為三個亞型,CH1配CL(CrossMabCH1-CL),VH配VL(CrossMabVH-VL),或VL-CL配VH-CH1(CrossMabFab)。CrossMab不需要序列優(yōu)化或附加接頭,成為設(shè)計新型bsAb的一種有吸引力的方法。此外,它可以與KiH結(jié)合,以確保重鏈的正確配對。

隨著基因工程技術(shù)的進步,以及噬菌體展示、蛋白質(zhì)工程、轉(zhuǎn)基因小鼠等多種方法的出現(xiàn),目前已發(fā)展出100多種bsAb形式。這些新開發(fā)的形式規(guī)避了以前的制造問題,如不穩(wěn)定、低收率和免疫原性,從而加速了從試驗臺到臨床的速度。如上所述,通用的bsAb格式可以簡單地分為兩類。一方面,除了quadromas、KiHs和CrossMab外,IgG-like形式還包括雙可變域Ig(DVD-Ig)、IgG單鏈Fv(IgG-scFv)、二合一或雙作用Fab抗體(DAF)和κλ-body等形式。

另一方面,非IgG樣形式包括單鏈抗體、納米抗體、dock and lock(DNL)方法和其他多價分子。單鏈抗體是指兩個來自親本Ab輕鏈和重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的組合,即VH和VL。它們通過一個肽接頭連接,通常是(G4S)3序列�；�于單鏈抗體的形式包括scFvs、sdAb、ta-scFv、diabodies、TandAbs和DART。在這種格式中,BiTE是最典型和應用最廣泛的一種。美國食品和藥物管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMA)分別于2014年12月和2015年12月批準了抗CD19×CD3的blinatumomab(Blincyto;Amgen),用于治療費城染色體陰性的復發(fā)或難治性前體B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALLs)。迄今為止,各種bsAb形式已在其他多個綜述中都有總結(jié)。

bsAb的臨床應用

bsAb的首次臨床試驗是在1990年進行的。利用化學偶聯(lián)的抗CD3單抗OKT3和抗膠質(zhì)瘤單抗NE150治療惡性膠質(zhì)瘤。1995年,bsAb首次通過靜脈注射抗CD3×CD19的bsAb治療化療耐藥的非霍奇金淋巴瘤(NHL)。令人失望的是,雖然觀察到有限的全身毒性,但該試驗沒有臨床反應,只觀察到血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)和CD8+T細胞增加。同年,第一個BiTE,由兩個靶向CD3和17-1A的單鏈抗體連接而成,也就是抗CD19×CD3的blinatumab的前體。1997年,針對FcγRIII(CD16)和霍奇金相關(guān)抗原CD30激活NK細胞的bsAb在臨床I/II期研究中顯示出令人鼓舞的抗腫瘤活性。利用重組DNA技術(shù),blinatumomab避開了以前產(chǎn)量低、副產(chǎn)品不明確和純化程序復雜的問題。一年后,Blinatumomab在德國和瑞典進入了人類研究的第一個階段,其中21例復發(fā)或難治性NHL患者接受短期靜脈注射。直到2004年,NHL患者才首次觀察到blinatumomab有意義的臨床反應,劑量為每天15?g/m2。幾年后,blinatumomab被用于廣泛的臨床試驗,直到最后通過FDA和EMA的批準。在隨后的幾年里,blinatumomab的治療范圍進一步拓寬,2018年,隨著FDA批準其用于首次或第二次完全緩解后MRD≥0．1%的pre-B ALL患者群體的治療,bsAb領(lǐng)域經(jīng)歷了爆炸式增長,未來臨床發(fā)展前景廣闊。

抗原變異逃逸的解決方案

為了同時處理兩個靶點,同時保持它們的效力,產(chǎn)生bsAb的第一步是確定合適的靶抗原。與傳統(tǒng)的Abs類似,bsab的靶點應滿足以下標準:(a)它們在靶細胞而不是鄰近的正常細胞中有明顯的表達,以避免非特異性毒性(也稱為“靶向非腫瘤”毒性);(b)它們與惡性腫瘤表型或防止抗原突變引起的免疫耐受的信號通路密切相關(guān)。目前,只有一小部分腫瘤相關(guān)抗原(TAA)被識別并嚴格滿足上述標準,這一點令人沮喪。其中CD19最具代表性,CD19在大多數(shù)B-ALL上表達,對B細胞的發(fā)育和功能是必不可少的,因此是CAR-T細胞或基于bsAb的免疫治療的重要靶點。然而,有報道稱,CD19特異性CAR-T細胞或抗CD19×CD3的BiTE在B-ALL治療中的失敗歸因于CD19的基因突變,導致CD19細胞外結(jié)構(gòu)域的丟失,構(gòu)象變化,向細胞表面的轉(zhuǎn)運受損,或從ALL到急性髓細胞白血病(AML)的表型轉(zhuǎn)化。因此,如果只有一個TAA靶向癌細胞,所選TAA的基因改變可能會對免疫治療的效果構(gòu)成威脅,這給我們帶來了一個巨大的挑戰(zhàn)。

策略1:發(fā)展多特異性抗體;以避免單一靶點相關(guān)的免疫無效,一些研究者提出多靶點抗體的想法,以同時識別靶癌細胞表面的多種抗原,提高親和力。例如,產(chǎn)生促紅細胞生成素的肝細胞(Eph)受體家族的三個成員EphA2、EphA4和EphB4參與了許多惡性腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移,它們都是很有吸引力的抗腫瘤治療靶點。在此基礎(chǔ)上,通過將抗EphB4/EphA4雙抗體連接到完整的抗EphA2抗體的C端,設(shè)計了一種三特異性抗體。這一策略的另一個例子是雙靶向單鏈抗體的三特異性抗體同時識別AML癌細胞上的CD123和CD33。與單靶向藥物相比,它表現(xiàn)出明顯更強的抗腫瘤活性。此外,靶向內(nèi)皮生長因子受體(EGFR)、HER2、HER3和VEGF的四特異性Abs在體外和體內(nèi)也顯示出比單靶向藥物更有效的抗腫瘤效果,并且能夠破壞其親本bsAb誘導的耐藥性。

策略2:新抗原的發(fā)現(xiàn);由于其高突變負荷和對當前腫瘤免疫治療明顯的耐藥性傾向,因此識別新抗原并確定相關(guān)內(nèi)在機制為改進抗腫瘤策略鋪平道路是一項挑戰(zhàn),但也是緊迫的任務(wù)。簡而言之,新抗原,也稱為腫瘤特異性抗原(TSA)來源于非同步體細胞突變,在腫瘤細胞中特異性表達,而在正常細胞中完全缺失。以前,大多數(shù)免疫療法針對的是TAA,因為它們通常在一組腫瘤類型中過度表達,因此覆蓋了更廣泛的患者群體,如CD19。然而,基于TAA治療的累積研究報告了正常組織潛在的損傷,同時臨床療效不理想。相反,TSAs在腫瘤細胞中有選擇性的表達,并且在不同的個體之間存在差異,從而為TSA依賴的免疫治療提供了個性化的機會。

一般來說,Ab靶點的選擇大致分為三代:(a)第一代由“已驗證抗原”組成,這些抗原已被廣泛的實驗和臨床試驗所證實;(b)第二代包括修飾肽,這意味著要么是與“驗證抗原”不同的表位,要么是屬性改進的相同表位;(c)第三代包括根據(jù)基因組學、蛋白質(zhì)組學或基于細胞的功能策略篩選出的那些新發(fā)現(xiàn)的抗原。顯然,TSAs的識別與第三代Ab靶點密切相關(guān)。從技術(shù)上講,全外顯子組測序與快速發(fā)展的軟件算法相結(jié)合是目前識別新抗原最有趣和最有前途的方法。全外顯子組測序是基因組相關(guān)技術(shù)中最重要的一種,包括獲取DNA樣本、將其拆分成碎片、篩選提取編碼片段,擴增片段,測序片段,最后用參考基因組分析結(jié)果。根據(jù)DNA密碼子配對原理,突變的DNA序列被轉(zhuǎn)化為抗原中的氨基酸交替。隨后,各種算法可用于預測對MHC分子具有高結(jié)合親和力的新抗原�；�于細胞的方法利用整個癌細胞作為平臺,選擇性地生成相應的單克隆抗體。篩選出與癌細胞表面抗原結(jié)合活性高的抗原。

避免T細胞無能免疫治療的組合策略

在宿主免疫監(jiān)視過程中,T細胞是抗原提呈細胞向T細胞受體(TCR)遞呈MHC肽復合物、提供二級共刺激信號激活原始T細胞、促進效應T細胞增殖的重要前哨細胞。相反,如果共刺激分子缺失或被共抑制分子替代,即免疫檢查點,T細胞功能失活或無能,從而無法特異性地清除腫瘤細胞。在眾多免疫檢查點中,程序性死亡受體1(PD-1,也稱為CD279)是最重要的以及廣泛研究的分子。它在TME的T細胞上表達,并與其配體PD-L1相互作用于腫瘤細胞或腫瘤浸潤淋巴細胞,介導腫瘤免疫抑制。同時,已觀察到bsAb依賴性治療的臨床療效不足可能部分歸因于TME中的免疫抑制,尤其是通過PD-1/PD-L1通路。例如,一項針對diabody格式的抗AC133×mCD3 bsAbs的研究報告了放療誘導腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的凋亡以及隨后腫瘤的生長,這是由PD-1途徑介導的。因此,額外的PD-1阻斷劑對增加TIL的數(shù)量非常有益,恢復抗腫瘤免疫效果,提高生存率。總的來說,組合策略主要包括免疫檢查點阻斷、CAR-T細胞和迄今為止的其他策略。

策略1:同時應用BSAB和免疫檢查點抑制單克隆抗體;免疫檢查點抑制劑的應用促進了T細胞協(xié)同抗腫瘤免疫治療的發(fā)展,特別是聯(lián)合應用,招募和動員T細胞對抗癌癥。在一項研究中,在小鼠模型中應用抗CD33×CD3的BiTE(AMG330)可導致腫瘤細胞PD-1上調(diào),并顯示出顯著受損的T細胞介導的腫瘤細胞溶解。相反,阻斷PD1/PD-L1相互作用增強了AMG330介導的細胞溶解。在另一項研究中,在anti-CEA×CD3的BiTE前雙重給藥抗PD-1和抗PD-L1單抗可有效地阻斷TME中的免疫抑制,并使效應T細胞的細胞毒性最大化。在臨床試驗中,聯(lián)合應用bsAb和免疫檢查點抑制劑也可以協(xié)同作用,提高抗腫瘤效果和患者生存率。此外,在先前的抗藥性HER2+乳腺癌治療研究中,觀察到使用HER2-TDB(一種基于曲妥珠單抗的T細胞招募bsAb)以及PD-L1抑制劑時的抗腫瘤效果。這些益處包括增強腫瘤生長抑制和增強反應持久性。最近,通過DNL方法構(gòu)建新型三價T細胞重定向bsAb,即,(E1)-3s和(14)-3s,分別針對Trop-2和CEACAM5,與PD-L1阻斷劑聯(lián)合應用,在體外和體內(nèi)均顯示出增強的抗腫瘤活性。

策略2:以免疫檢查點為靶點的bsAb;這是同時利用免疫檢查點阻斷和bsAb技術(shù)的另一個有吸引力的選擇,結(jié)果是設(shè)計同時針對免疫檢查點和腫瘤抗原的bsAb,這在策略上優(yōu)于免疫檢查點抑制劑和bsAb的組合。從機制上講,這是通過與TAA陽性癌細胞中的PD-1/PD-L1阻斷劑結(jié)合來實現(xiàn)的。例如,一種抗PD-L1×EGFR bsAb來激活EGFR過表達腫瘤細胞中的PD-L1阻斷劑。它具有對稱的四價taFv-Fc形式的結(jié)構(gòu),具有一個Fc域來介導相關(guān)功能。已證實,抗PDL1×EGFR-bsAb可增強腫瘤部位的Ab積聚,同時預防多種上皮性惡性腫瘤(如結(jié)直腸癌和非小細胞肺癌)的嚴重系統(tǒng)性自身免疫相關(guān)不良事件。同樣,一些研究人員設(shè)計了兩種新的bsAb:抗PD-1×c-Met DVD-Ig和IgG單鏈抗體,這兩種抗體在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出有效的抗腫瘤免疫活性。同樣,另一種靶向PD-L1和硫酸軟骨素蛋白多糖4(CSPG4)的bsAb用于治療黑色素瘤和其他CSPG4+惡性腫瘤時,在維持PD-1/PD-L1的安全性的同時,也有助于提高抗腫瘤的療效和選擇性。此外,使用抗CD33×CD3的BiTE作為支架,將PD-1的胞外區(qū)域融合到該支架上,以產(chǎn)生一種三特異性抗體,招募T細胞到CD33+AML細胞,并阻斷PD-1的免疫檢查點通路。

雖然目前關(guān)于bsAb和免疫檢查點阻斷的聯(lián)合研究大多集中在PD-1/PD-L1通路上,但其他免疫檢查點,如細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4(CTLA-4,CD152)和T細胞Ig粘蛋白3(TIM-3)也在免疫抑制性TME中發(fā)揮著不可或缺的作用。為進一步降低外周毒性而僅對腫瘤區(qū)域進行免疫檢查點阻斷,正在創(chuàng)造性地設(shè)計一組新的bsAb,以同時針對兩個不同的免疫檢查點,例如CrossMab格式的抗PD-1/TIM-3 bsAb,或靶向檢查點抑制劑和T細胞共刺激受體,以IgG1形式的anti-CTLA-4×OX40bsAb(命名為ATOR 1015)。

策略三:結(jié)合CAR-T細胞療法提供共刺激信號;除上述T細胞免疫抑制信號外,在缺乏共刺激信號的情況下,通過CD28或4-1BB(CD137)分子持續(xù)刺激TCR-CD3信號通路是效應器T細胞無能或凋亡的另一個重要解釋。最初,這個問題是通過使用抗4-1BB的單克隆抗體或4-1BBL的胞外域或抗CD28單抗作為佐劑輔助bsAb治療來解決的,顯示出效應T細胞激活時間的延長。此外,通過將腫瘤壞死因子超家族的兩個成員(包括CD40L、CD27L、OX40L和4-1BBL)融合到一個T細胞重定位的diabody,最終增強T細胞刺激并提高抗腫瘤活性。然而,這些解決方案顯示效應T細胞的持續(xù)時間相對較短。為了解決這一問題,一組研究人員提出了一種新型的T細胞靶向復合物來根除AML細胞,該復合物包括一個抗CD3×肽表位(E5B9)bsAb,即一個通用效應器模塊和一個目標模塊,該模塊由一個與肽表位(E5B9)融合的抗CD33單鏈抗體和一個4-1BBL的胞外域組成。與傳統(tǒng)的抗CD33×CD3的bsAb相比,該復合物不僅在激活T細胞和誘導CD33+腫瘤細胞溶解方面具有更高的療效,而且通過額外的共刺激信號增強對CD33低表達細胞的殺傷作用。更重要的是,這種新穎、靈活的模塊化系統(tǒng)可使抗腫瘤功能長期增強,在腫瘤中具有廣泛的應用潛力。此外,為了提供長效效應T細胞功能,其他研究人員已經(jīng)制定了一種優(yōu)化策略,將bsAb策略與CAR-T細胞策略相結(jié)合,產(chǎn)生了一組新的bsAb。這種新的bsAb,命名為frBsAb,是由兩個單抗的化學異共軛,融合葉酸受體(FR)和所選擇的TAA。相應地,轉(zhuǎn)化的T細胞被稱為BsAb-IR28z,其細胞外FR結(jié)構(gòu)域連接到CD8α-鉸鏈和跨膜區(qū);細胞內(nèi)CD3z部分與CD28融合。因此,當frBsAbs將腫瘤細胞(通過對TAA的識別)交聯(lián)到介導的T細胞時,它們不僅誘導短暫的T細胞活化,而且通過同時刺激共刺激分子CD28防止無能或抗原誘導的細胞死亡,最終發(fā)揮增強的抗腫瘤能力。在共刺激分子中,CAR-T細胞和bsAbs的結(jié)合也提供了許多優(yōu)點,并且作為一種有前途的治療惡性腫瘤的方法正在獲得發(fā)展。最近,人們又設(shè)計了一種用于治療多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)的單一基因修飾T細胞產(chǎn)物CAR-T-EGFRvIII。BiTE-EGFR細胞分泌額外的抗EGFR×CD3,同時保持傳統(tǒng)的CAR-T細胞骨架,并在T細胞表面表達EGFRvIII。由于EGFR和EGFRvIII都是GBM腫瘤細胞的關(guān)鍵靶點,這種創(chuàng)新性的發(fā)明比CAR-T細胞和bsAb作為單一療法更具優(yōu)勢,因為它不僅證實了抗原陽性腫瘤亞型的有效抗腫瘤反應,而且對健康組織相對安全,而且還避免了其親本技術(shù)的缺點,如腫瘤抗原異質(zhì)性、全身應用相關(guān)非特異性毒性、持續(xù)注射的必要性、出現(xiàn)免疫抑制、T細胞衰竭等。

本質(zhì)上,到目前為止,一組創(chuàng)新的通用或模塊化的CAR-(modCAR-)T細胞及其各自的適配器分子(CAR適配器)已經(jīng)被用來規(guī)避傳統(tǒng)CAR-T細胞的一些致命的副作用。該策略將TAA識別和T細胞激活分為兩部分,并依賴于CAR適配器作為橋梁,將modCAR-T細胞重定位于多個TAA,并使用相同的modCAR-T細胞來靶向多種腫瘤類型,這樣可以精細調(diào)節(jié)效應T細胞的功能而無需清除掉它們。目前,CAR適配器可根據(jù)其結(jié)構(gòu)分為幾個亞型,包括小分子(如葉酸和異硫氰酸熒光素)、單價和二價納米體、單鏈抗體、Fabs和Abs。

雙特異性策略與NK細胞

迄今為止,增強抗腫瘤免疫的大多數(shù)嘗試都集中在通過CAR-T細胞或bsAb來增強T細胞的反應,特別是在blinatumomab成功后。然而,值得注意的是,這種T細胞靶向治療受到一些毒副作用的限制,其中最具挑戰(zhàn)性的是致命的細胞因子釋放綜合征(CRS)。盡管人們已經(jīng)做出很大努力通過阻斷IL-6或抑制單核細胞/巨噬細胞活化來逆轉(zhuǎn)CRS,但在保持充分治療潛力的同時實現(xiàn)最佳毒性管理仍然是一個挑戰(zhàn)。此外,由于大多數(shù)T細胞重定位靶向bsAb旨在對抗血液惡性腫瘤,bsAb介導的關(guān)于實體瘤的治療還需要進一步的研究。NK細胞作為天然免疫抗腫瘤的一線戰(zhàn)士,在過去的幾十年里也引起了廣泛的關(guān)注。在人類中,各種研究表明NK細胞功能受損或缺失與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的高風險密切相關(guān)。值得注意的是,高比例的NK細胞浸潤實體瘤與更好的臨床療效相關(guān),這已在結(jié)直腸癌、乳腺癌、透明細胞腎癌、頭頸癌和咽部癌中得到證實。因此,通過免疫治療靶向NK細胞是一種很有吸引力的抗腫瘤策略。

從機制上講,活化的NK細胞可以通過三種直接或間接的策略清除腫瘤細胞:(a)釋放顆粒,如分泌性溶酶體,其中含有穿孔素和顆粒酶,誘導細胞膜溶解或凋亡;(b)通過腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體和Fas配體在腫瘤細胞上的相互作用來激活靶細胞caspase;(c)分泌多種因子調(diào)節(jié)其他免疫細胞功能,間接殺傷腫瘤細胞�；�于這些理論,NK細胞接合器(NKCEs)和CAR-NK細胞被設(shè)計用來利用NK細胞介導的細胞毒性來對抗腫瘤。NKCE是通過連接抗NK細胞受體(主要是CD16)和一個TAA (bispecific killer engagers, BiKEs)或兩個TAA(trispecific killer engagers, TriKEs)的單鏈抗體來構(gòu)建的。到目前為止,抗CD16的BiTEs已經(jīng)被有效地用于針對廣泛的TAA,包括CD19、CD20、CD30、CD33、CD133和EPCAM。

抗CD30×CD16A的BiKE(AFM13)的治療復發(fā)或難治性CD30+霍奇金淋巴瘤或NHL的I/II期臨床試驗結(jié)果已發(fā)表。有趣的是,在一項骨髓增生異常綜合征(MDS)的研究中,抗CD16×CD33的BiKE不僅能根除CD33+MDS細胞,而且還能靶向CD33+髓源性抑制細胞,以逆轉(zhuǎn)TME中的免疫抑制,提高抗腫瘤的療效。相比之下,使用額外的單鏈抗體,TriKEs通過靶向更多的taa或共同作用更多的NK細胞激活受體靶獲得了更多的益處。最近,報道了一種顯著的三功能NKCE,它與NK細胞上的CD16和NKp46(一種天然細胞毒性受體(NCR))以及腫瘤細胞上的TAA共同作用。在侵襲性和實體性B細胞淋巴瘤的小鼠模型中,這種設(shè)計巧妙的TriKE導致NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性充分激活和增強,并顯示出比分別激活CD16和NKp46的BiKE更有效的抗腫瘤功能。此外,另外一個設(shè)計增加了IL-15交聯(lián)劑,將抗CD16×CD33的BiKE升級為TriKE,由于NK細胞自我持續(xù)增殖,從而提高了腫瘤細胞殺傷效率。值得注意的是,抗CD16×IL-15×CD33的TriKE(GTB-3550)的單中心I/II期臨床試驗已經(jīng)在進行中,用于治療CD33+高危MDS,難治性/復發(fā)性AML,或晚期全身性肥大細胞增多癥。除了優(yōu)越的抗腫瘤作用外,BiKE和TriKE還比T細胞接合器具有更低的毒性和更高的安全性,這意味著CRS或非靶向細胞毒性的風險更低,在實體腫瘤中的應用前景更廣闊。與NKCE類似,成熟的NK細胞也可以作為一個有趣的候選細胞來表達CARs,對抗豐富的TAA,如CD19、CD20、CD244和HER2。

原位bsAb

盡管bsAb取得了巨大的成功,但外源性給藥的治療潛力受到了短循環(huán)動力學和靶向非腫瘤毒性的阻礙。因此,研究人員提出了原位生成bsAb的概念,以克服免疫抑制性TME,避免持續(xù)的藥物輸注。目前,在腫瘤組織中制備bsAb的方法主要有工程溶瘤病毒(OVs)、轉(zhuǎn)染T細胞和轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞(MSCs)。

2015年,FDA批準了Imlygic,即轉(zhuǎn)基因溶瘤HSV療法 talimogene laherparepvec(T-VEC),并表達GM-CSF,用于治療晚期黑色素瘤。這代表了OVs的一個里程碑,并促進了大量的臨床前研究和臨床試驗。由于腫瘤特異性表達和病毒介導的T-cell募集的優(yōu)勢,OVs是一個誘人的bsAb輸送平臺。目前,這些攜帶BiTEs的OVs正在進行臨床前評估:產(chǎn)生抗CD3×EphA2 BiTE的EphA2-T細胞疫苗病毒;抗EGFR×CD3 BiTE的腺病毒(ICOVIR-15K);抗CD3×CEA/CD20 BiTE的麻疹病毒(MV-BiTE);抗EpCAM×CD3 BiTE的工程化溶瘤B組腺病毒Enadenoutucirev(EnAd)。第一個攜帶BiTE的OV是一個雙清除的痘苗病毒(western reverse Straine),其被設(shè)計為編碼EphA2靶向BiTE,在A549肺癌異種移植模型中,加入外源性IL2可提高T細胞的體外活化和增殖,并提高存活率。后來,研究人員對腺病毒ICOVIR-15K進行了修飾,以產(chǎn)生抗EGFR×CD3的BiTE,成功地在不增加IL-2的情況下促進T細胞增殖。另一個類似的結(jié)構(gòu),MV-BiTE,為免疫功能正常的小鼠和實體瘤異種移植模型提供持續(xù)的免疫保護,并促進腫瘤的長期消退而不復發(fā)。攜帶抗EpCAM×CD3 BiTE的EnAd進一步顯示了殺死靶細胞的能力,同時克服了人類原發(fā)惡性腹水樣本中的免疫抑制性TME�？偟膩碚f,工程化產(chǎn)生BiTE的OVs可以通過非特異性的直接溶瘤或感染抗原陽性的癌細胞來攻擊和殺死癌細胞,然后是BiTE的復制依賴性表達,激活內(nèi)源性CD4+和CD8+T細胞,從而對這些癌細胞產(chǎn)生免疫介導的細胞毒性。這種改進的溶瘤病毒療法由于其優(yōu)于傳統(tǒng)的OVs或bsAb而具有光明的前景:(a)來自修飾OVs的biTEs選擇性地靶向抗原陽性的癌細胞,而不依賴于MHC/TCR分子呈現(xiàn)或其他共刺激信號,因此,即使在癌細胞失去MHC表達的情況下,也能提高抗腫瘤T細胞反應的效力并激發(fā)免疫。(b) 在晚期病毒啟動子的控制下,通過限制病毒感染癌細胞的持續(xù)BiTE產(chǎn)生,不僅使系統(tǒng)毒性最小化,而且使BiTE在TME中的濃度大大提高,同時也解決了BiTE的半衰期短的問題。(c) OVs主要在癌細胞中感染和復制,并在細胞間傳播,減輕了鄰近健康組織的損傷。(d)BiTE既可以針對病毒感染的癌細胞,也可以針對未感染抗原陽性的癌細胞。(e) 改良OVs可刺激CD4+和CD8+T細胞介導免疫,同時規(guī)避免疫抑制。(f) 該方法安全性高,毒副作用小,應用方便。此外,與靶向腫瘤抗原的改良OVs類似,攜帶BiTEs靶向間質(zhì)細胞抗原的OVs對難治性、富間質(zhì)性腫瘤有較好的療效。編碼以成纖維細胞活化蛋白(FAP)為靶點的基因工程酶,不僅可以殺死感染和復制的腫瘤細胞,而且還可以利用隨后產(chǎn)生的抗FAP的BiTE激活T細胞,選擇性地耗盡FAP+癌相關(guān)成纖維細胞(CAFs)。它們最終逆轉(zhuǎn)CAF介導的免疫抑制,打破間質(zhì)屏障,使OVs滲透到腫瘤部位,并協(xié)同使TME恢復到免疫反應狀態(tài)。

轉(zhuǎn)染自體腫瘤特異性T細胞;目前,轉(zhuǎn)染的自體腫瘤特異性T細胞由于實現(xiàn)了CAR-T細胞與bsAb的理論結(jié)合,并克服了兩者的局限性而備受關(guān)注。近十年前,當人類外周血淋巴細胞,尤其是CD3+T細胞,被工程化的基于HIV-1的慢病毒載體轉(zhuǎn)染,在體內(nèi)產(chǎn)生抗CEA×CD3 diabody的細胞時,淋巴細胞首次被認為是bsAb的載體。最近,CD123-ENG T細胞可以證明這一點,它是由一種編碼雙特異性接合器分子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導的,該分子靶向AML和CD3+T細胞的CD123+腫瘤細胞。從機制上講,ENG T細胞不僅識別和殺死CD123+腫瘤細胞,而且通過抗原依賴性的BiTE分泌,將未修飾的旁觀者T細胞重定向并激活到腫瘤部位,協(xié)同產(chǎn)生強大的抗腫瘤免疫反應。此外,為了避免對正常造血干細胞和祖細胞的意外和過度殺傷,CD20．CD123-ENG T細胞被設(shè)計為包含自殺基因CD20,它允許在利妥昔單抗和補體存在下選擇性耗竭。其他類似的ENG T細胞包括EphA2-ENG T細胞和CD19-ENG T細胞。此外,一些研究人員通過mRNA電穿孔技術(shù)和快速T細胞擴增方案構(gòu)建了CD19-BiTE轉(zhuǎn)移的T細胞,在體外和侵襲性Nalm6白血病小鼠模型中,與CAR RNA轉(zhuǎn)染的T細胞相比,其抗腫瘤免疫能力也得到增強。轉(zhuǎn)基因T細胞顯示出明顯的優(yōu)越性,因為一旦被激活,就會產(chǎn)生增強的BiTE,將駐留的T細胞重新定向到腫瘤部位。為了進一步提高抗腫瘤效率,將共刺激分子CD28和/或4-1BBL引入ENG T細胞表面,即CD19-ENG．4-1BBL/CD80,顯著增加抗原依賴性細胞因子(IL-2和IFNγ)的產(chǎn)生,并促進T細胞的增殖,最終在體內(nèi)外表現(xiàn)出最佳反應。

轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)除了腫瘤細胞和T細胞外,MSC也可以作為一種細胞載體,實現(xiàn)bsAb的原位穩(wěn)定表達。骨髓間充質(zhì)干細胞具有免疫原性低、向腫瘤部位遷移的趨勢、追蹤顯微轉(zhuǎn)移的能力以及易于通過病毒載體進行轉(zhuǎn)導的獨特優(yōu)勢。在一項研究中,通過慢病毒載體對永生化人源性MSC系(SCP-1)進行了基因修飾,以產(chǎn)生完全人源化的抗CD33×CD3 bsAb提高共刺激分子4-1BBL的表達。增強的抗抗原特異性T細胞反應使MSCs成為bsAb靶向腫瘤的有效傳遞者,從而延長腫瘤消退時間。另一項研究使用轉(zhuǎn)染的人臍帶來源的MSCs分泌抗CD19×CD3 TandAbs,同時使用吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)途徑抑制劑,D-1MT,證明這種組合是一種很有前途的治療策略。此外,E1A修飾的MSCs也可以被設(shè)計成病毒轉(zhuǎn)運體和放大器,釋放工程腺病毒并在到達腫瘤部位或轉(zhuǎn)移灶后重新感染腫瘤細胞,它們分泌bsAb并激活T細胞對腫瘤的反應。這是一個雙重病毒裝載MSC(命名為MSC．CD3-HAC．E1A)攜帶雙功能融合蛋白CD3-HAC,由抗CD3單鏈抗體和高親和力共識(HAC)PD-1組成,最終促進腫瘤的消除和逆轉(zhuǎn)TME的免疫耐受。

Minicircle(MC);MC是體內(nèi)生產(chǎn)bsAb的另一種有前途的替代品。它是一組非病毒性的DNA載體,通過流體動力學過程將轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物輸送到小鼠肝臟后,能夠持續(xù)高水平地表達轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。一些研究人員利用MC設(shè)計了MC-bsAb,生成了抗CD20×CD3-bsAb,在體外和異種移植小鼠模型中介導T細胞殺傷人類B細胞淋巴瘤細胞。這種方法非常有吸引力,因為它相對穩(wěn)定,價格低廉,并且能夠在數(shù)周甚至更長時間內(nèi)維持血液循環(huán)中的bsAb的治療濃度。

展望

在過去的30年里,人們目睹了一個巨大的轉(zhuǎn)變,從僅僅開發(fā)和改造基本的Abs,發(fā)展到更復雜的Ab衍生物,其形狀和尺寸多種多樣,尤其是bsAb。bsAb技術(shù)在臨床應用中具有非凡的前景,吸引了研究人員的注意并已發(fā)展出極為豐富的形式,為基于BSAB的癌癥免疫治療奠定了堅實的基礎(chǔ)。截至2019年9月20日,NCBI的官方網(wǎng)站上共發(fā)布了183項bsAb的臨床試驗(大多數(shù)在癌癥領(lǐng)域)。然而,盡管有上述各種各樣的策略,商業(yè)化生產(chǎn)bsAb藥物的過程仍然受到各種障礙的阻礙。更具體地說,bsAb的制造既耗時又昂貴。它需要合適、安全、經(jīng)濟的細胞系生產(chǎn)、程序、分析和純化方法來獲得所需的產(chǎn)品。此外,Ab生產(chǎn)后的一系列問題,包括但不限于Abs的降解、聚集、變性、破碎和氧化,必須在給到患者之前解決。同時,還需要更多的臨床試驗來探索最佳給藥途徑和最佳劑量,以提高靶組織的濃度,減少全身副作用,甚至是控釋制劑。

總體而言,據(jù)估計,目前臨床試驗中的大多數(shù)bsAb(67%)旨在對抗血液惡性腫瘤。相比之下,靶向?qū)嶓w腫瘤的bsAb值得進一步研究,因為其對正常組織或其他復雜因素(包括免疫耐受性癌間質(zhì)、新生血管紊亂,bsAb藥物的滲透不足)有不可避免的不良影響。因此,人們對正在進行的實體腫瘤中的bsAb研究充滿熱情,這些研究有望在不久的將來產(chǎn)生有希望的結(jié)果,盡管將bsAbs轉(zhuǎn)化為臨床適用的藥物可能耗時且需要大量的努力。總之,bsAb研究的結(jié)果證明了這些分子在新的藥物設(shè)計和隨后的癌癥治療臨床應用中的前景。

參考文獻:

Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics． Cell Mol Immunol． 2020 May;17(5):451-461．