侵權(quán)投訴
訂閱
糾錯
加入自媒體

CRISPR/Cas9在阿爾茨海默癥中的應(yīng)用前景

關(guān)注小藥說藥,一起成長!

前言

阿爾茨海默癥(AD)是一種進(jìn)行性、不可逆的神經(jīng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)為認(rèn)知障礙、行為異常和社會缺陷。據(jù)預(yù)測,到2050年,美國65歲及以上老年癡呆癥患者的數(shù)量可能會達(dá)到1380萬。在中國,超過1507萬60歲或以上的老年人患有癡呆癥,其中約983萬人患有AD。

目前,AD的發(fā)病機(jī)制還不清楚。β-淀粉樣蛋白沉積和tau蛋白過度磷酸化被廣泛認(rèn)為是AD發(fā)病的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。此外,其他年齡相關(guān)、保護(hù)性和疾病促進(jìn)因素可能與AD的核心機(jī)制相互作用,并可能參與AD的發(fā)病。

近年來,CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速,在基礎(chǔ)研究和疾病治療領(lǐng)域顯示出巨大的潛力。最近,基因編輯技術(shù)被評估為AD研究和治療的一種有前途的方法。CRISPR/Cas9在AD模型構(gòu)建、致病基因篩選和靶向治療等方面具有極大的應(yīng)用潛力。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)本質(zhì)上是一種針對外源DNA的細(xì)菌防御機(jī)制。CRISPR最初發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)80年代末,是一種由交替重復(fù)和非重復(fù)DNA序列組成的不尋常的遺傳結(jié)構(gòu);蚪M分析表明,CRISPR和Cas蛋白作為獲得性免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用,并通過RNA引導(dǎo)的DNA切割系統(tǒng)保護(hù)原核DNA免受噬菌體和質(zhì)粒DNA的攻擊。

當(dāng)外源DNA侵入細(xì)菌時,其DNA片段作為間隔子并入CRISPR位點。然后將該位點轉(zhuǎn)錄到CRISPR前RNA(crRNA),該RNA附著到組成性形成的反式激活RNA(tracrRNA)上,由CRISPR相關(guān)蛋白修飾成gRNA。當(dāng)gRNA與非活性Cas9復(fù)合物的REC I結(jié)構(gòu)域結(jié)合時,該復(fù)合物被激活,導(dǎo)致gRNA及其互補單鏈DNA形成異源雙鏈。Cas9的HNH和RuvC核酸酶域隨后分別切割互補和非互補DNA鏈。

Cas9屬于1類CRISPR-Cas系統(tǒng)的II型,來源于化膿鏈球菌。Cas9與靶序列的偶聯(lián)需要一個原間隔基鄰近基序(PAM),一個小的入侵基因組中的3-8bp DNA序列,PAM在區(qū)分細(xì)菌自身和非自身DNA以及成功結(jié)合Cas9方面至關(guān)重要。

與ZFN和TALEN不同,ZFN和TALEN依賴于每個特定基因序列的精細(xì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物,CRISPR/Cas9系統(tǒng)依賴于gRNAs,使其成為更靈活的平臺。Cas9蛋白保持不變,而gRNA可以方便地根據(jù)每個基因進(jìn)行定制。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的另一個優(yōu)點是,它使得在多個基因座上同時進(jìn)行基因編輯成為可能,與以前的系統(tǒng)相比,它提供了一個更高效和可擴(kuò)展的平臺。

CRISPR/Cas9應(yīng)用于AD模型的構(gòu)建

細(xì)胞模型由于不涉及倫理問題,實驗周期相對短,成本低,因此在包括AD在內(nèi)的各種神經(jīng)疾病的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。在過去的幾十年中,建立了許多AD的體外細(xì)胞模型。迄今為止,AD研究中常用的細(xì)胞系包括人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y和SK-N-SH、小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22和膠質(zhì)細(xì)胞BV2以及小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞N2a。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)可以促進(jìn)更有效地開發(fā)AD細(xì)胞模型。

例如,通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)下調(diào)HT22細(xì)胞中硫氧還蛋白相互作用蛋白(Txnip)水平可有效減弱β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)半胱氨酸氧化修飾。研究結(jié)果表明,Txnip可能是治療AD的一個治療靶點。

除了構(gòu)建AD細(xì)胞模型外,CRISPR/Cas9技術(shù)還可用于構(gòu)建AD動物模型。2020年,Serneels等人通過使用CRISPR/Cas9策略在小鼠和大鼠的APP基因中生成人源化aβ序列(G676R、F681Y和R684H),創(chuàng)建了一個名為Apphu/hu的新模型。通過在嚙齒類動物Aβ序列中插入三種氨基酸,Aβ的水平比原始野生型菌株增加了三倍以上。

CRISPR/Cas9應(yīng)用于AD致病基因的篩選

阿爾茨海默癥分為散發(fā)性(SAD)和家族性(FAD)。APP、PSEN1和PSEN2是引起FAD的主要致病基因,每個基因的突變都可能導(dǎo)致FAD的發(fā)生。然而,95%以上的AD病例是散發(fā)性的,SAD致病基因的篩選對于了解AD的分子發(fā)病機(jī)制、早期診斷、風(fēng)險預(yù)測和治療至關(guān)重要。

高通量測序和CRISPR/Cas9的發(fā)展為SAD致病基因的篩選提供了很大的幫助。例如,研究發(fā)現(xiàn),通過CRISPR系統(tǒng)敲除IPSC中的TREM2,小膠質(zhì)細(xì)胞的存活、載脂蛋白E的清除和SDF-1α/CXCR4介導(dǎo)的趨化性都受到嚴(yán)重影響,最終導(dǎo)致對β淀粉樣斑塊的損傷反應(yīng)。此外,Duan等人設(shè)計了基于成像的陣列CRISPR,用于研究與AD特征相關(guān)的基因。這也將提供一個探索AD生物學(xué)的平臺和藥物發(fā)現(xiàn)的機(jī)會。

CRISPR/Cas9應(yīng)用于AD的靶向治療

CRISPR/Cas9靶向APP基因突變

APP基因的突變導(dǎo)致Aβ前體蛋白的β-分泌酶切割增加,從而導(dǎo)致顯性遺傳性AD。Gyorgy等人報告,當(dāng)使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除APP等位基因時,Aβ蛋白的表達(dá)降低。因此,CRISPR/Cas9系統(tǒng)可能為具有APP突變的AD患者提供基因治療策略。

CRISPR/Cas9靶向Aβ蛋白的關(guān)鍵酶

Aβ蛋白是通過BACE1和γ-分泌酶對APP進(jìn)行順序修飾形成的。因此,靶向BACE1和γ-分泌酶是治療AD的一種潛在治療策略。Park等人報告,在兩種AD小鼠模型中,通過使用CRISPR/Cas9成功降低了BACE1的表達(dá)。γ-分泌酶由γ-分泌酶激活蛋白(GSAP)調(diào)節(jié),Wong等人利用CRISPR-Cas9技術(shù)在穩(wěn)定表達(dá)APP的HEK293細(xì)胞中敲除GSAP,導(dǎo)致Aβ分泌和γ-分泌酶活性顯著降低。

CRISPR/Cas9靶向編輯載脂蛋白E基因型

APOE4亞型是SAD最強(qiáng)的遺傳風(fēng)險因素。眾所周知,APOE主要由中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。Wadhwani等人關(guān)于APOE4治療靶點的研究表明,當(dāng)通過CRISPR/Cas9方法將兩名AD患者的IPSC中的E4等位基因更正為E3/E3基因型時,E3神經(jīng)元對離子霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性不太敏感,并且表現(xiàn)出tau磷酸化的降低。此外,Lin等人利用hiPSC和CRISPR/Cas9技術(shù)鑒定了APOE4的功能,他們的結(jié)果表明APOE4以不同的方式影響Aβ代謝。這些發(fā)現(xiàn)表明APOE4可能是治療AD的一個有希望的靶點。

CRISPR/Cas9靶向促炎分子

人類基因關(guān)聯(lián)研究表明,免疫反應(yīng)也是AD病因的主要途徑。越來越多的證據(jù)表明慢性神經(jīng)炎癥在AD中的重要性。CD33是一種免疫調(diào)節(jié)受體,在中性粒細(xì)胞上高水平表達(dá),在小膠質(zhì)細(xì)胞上低水平表達(dá),在調(diào)節(jié)AD病理學(xué)的吞噬功能方面具有不同的作用。Bhattacherjee等人的最新研究表明,通過CRISPR/Cas破壞CD33基因,并替換為hCD33的保護(hù)性變體,可以減輕Aβ病理和神經(jīng)退行性變。

膠質(zhì)成熟因子(GMF)是一種新發(fā)現(xiàn)的促炎癥分子,主要在淀粉樣斑塊周圍的反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),并在各種AD腦區(qū)高度表達(dá)。GMF的過度表達(dá)通常通過激活p38 MAPK信號通路和氧化毒性導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。Raikwar等人通過CRISPR/Cas9方法成功降低BV2細(xì)胞中的GMF表達(dá),從而抑制pp38 MAPK以調(diào)節(jié)GMF誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞促炎癥反應(yīng)。

半胱氨酸白三烯(Cys-LTs)是一組炎癥脂質(zhì)分子,通過兩種主要的G蛋白偶聯(lián)受體(CysLT1R和CysLT2R)啟動炎癥信號級聯(lián)反應(yīng)。近年來,越來越多的證據(jù)表明CysLT1R與AD的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),并可通過NF-κB途徑介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Chen等人證明,通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)刪除CysLT1R可減少APP/PS1小鼠的淀粉樣病變并減輕神經(jīng)炎癥。

小結(jié)

基因編輯由于其在科學(xué)研究和疾病治療中廣泛而有效的應(yīng)用前景,近年來進(jìn)入了一個蓬勃發(fā)展的時期。最近,已有許多關(guān)于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的AD相關(guān)研究,主要涉及利用該技術(shù)構(gòu)建AD模型、篩選致病基因以及通過特定靶基因(如APP、BACE1、APOE4、CD33、GMF和CysLT1R)治療AD。然而,考慮到該技術(shù)中潛在的非靶向錯配和特異性組織靶向性,CRISPR-Cas9最終應(yīng)用于AD的臨床治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)。

總之,CRISPR/Cas9作為本世紀(jì)的基因編輯技術(shù)的突破性進(jìn)展,為臨床基因治療開辟了新的途徑。與其他基因編輯技術(shù)相比,CRISPR-Cas9系統(tǒng)具有周期短、細(xì)胞毒性低、價格低廉、傳遞簡單等優(yōu)點。因此,盡管考慮到仍存在一些缺點,CRISPR-Cas9系統(tǒng)在AD的臨床治療中仍具有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn):

1. Application of CRISPR/Cas9 in Alzheimer’sDisease. Front Neurosci. 2021; 15: 803894.

       原文標(biāo)題 : CRISPR/Cas9在阿爾茨海默癥中的應(yīng)用前景

聲明: 本文由入駐維科號的作者撰寫,觀點僅代表作者本人,不代表OFweek立場。如有侵權(quán)或其他問題,請聯(lián)系舉報。

發(fā)表評論

0條評論,0人參與

請輸入評論內(nèi)容...

請輸入評論/評論長度6~500個字

您提交的評論過于頻繁,請輸入驗證碼繼續(xù)

暫無評論

暫無評論

醫(yī)療科技 獵頭職位 更多
文章糾錯
x
*文字標(biāo)題:
*糾錯內(nèi)容:
聯(lián)系郵箱:
*驗 證 碼:

粵公網(wǎng)安備 44030502002758號