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文章背景簡介  

BACKGROUND INTRODUCTION

光感受器是檢測和響應(yīng)光質(zhì)量和強(qiáng)度變化的蛋白質(zhì)機(jī)制，在最新的研究中表明，光感受器已經(jīng)允許作為一種新的遺傳工具。光遺傳學(xué)利用各種光感受器直接通過光照來控制細(xì)胞行為，其作為一種基于合成生物學(xué)的生物過程設(shè)計，最近引起了人們的關(guān)注。

藍(lán)藻具有多種光傳感系統(tǒng)，可有效調(diào)節(jié)光合作用，避免強(qiáng)光或短波長光引起的光抑制。在以往研究中，人們通過利用藍(lán)藻細(xì)菌中的各種光感受器，開發(fā)出了一種綠光誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)。一種藻膽素體連接體的表達(dá)基因cpcG2是由傳感器組氨酸激酶CcaS和同源反應(yīng)調(diào)節(jié)因子CcaR進(jìn)行染色質(zhì)調(diào)控。利用內(nèi)源性CcaS／CcaR系統(tǒng)，將cpcG2的修飾啟動子PcpcG2插入載體質(zhì)粒的上游，對外源性誘導(dǎo)基因進(jìn)行綠光調(diào)控。此外，來自聚囊藻的CcaS、CcaR和PcpcG2、PCC6803已轉(zhuǎn)化到海洋藍(lán)藻聚球菌NKBG 15041c作為外源性綠光調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)已應(yīng)用于藍(lán)藻細(xì)菌綠光調(diào)節(jié)自溶系統(tǒng)的構(gòu)建，采用了在綠光調(diào)節(jié)基因表達(dá)控制下的T4噬菌體衍生的裂解系統(tǒng)。

然而，藍(lán)藻光感受器的應(yīng)用不僅局限于其本身，而且也可用于非光合微生物。Tabor等人的一項開創(chuàng)性研究實現(xiàn)了藍(lán)藻桿菌衍生的綠光傳感系統(tǒng)可以在大腸桿菌中功能性表達(dá)和利用。由于CcaS的發(fā)色團(tuán)藻藍(lán)膽素（PCB）在大腸桿菌中不是內(nèi)源性合成的，因此PCB合成基因盒與CcaS／CcaR系統(tǒng)共表達(dá)導(dǎo)致了大腸桿菌中綠光調(diào)控基因的表達(dá)。Tabor和他的同事還報道了一種使用工程CcaS的多色基因表達(dá)系統(tǒng)。

2016年2月15日，日本東京農(nóng)業(yè)科技大學(xué)的OMitsuharu Nakajima等人在MICROBIAL CELL FACTORIES期刊《BIOTECHNOLOGY ＆ APPLIED MICROBIOLOGY》（生物工程與應(yīng)用微生物2區(qū)IF＝5．328）發(fā)表了“Development of a light－regulated cell－recovery system for non－photosynthetic bacteria”文章。在本研究中，作者構(gòu)建了一種以非光合微生物為基礎(chǔ)的調(diào)控生物過程的技術(shù)，即光調(diào)節(jié)的細(xì)胞恢復(fù)系統(tǒng)。它采用雙組分基因表達(dá)系統(tǒng)CcaS／CcaR控制的綠光調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)作為光調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)。對于細(xì)胞回收技術(shù)，作者選擇了大腸桿菌的自聚集系統(tǒng)�？乖�43（Ag43）是一種來自大腸桿菌的自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是感染過程中聚集和生物膜形成的必要蛋白。Ag43由三個結(jié)構(gòu)域組成：一個用于分泌到周質(zhì)空間的信號肽，一個β結(jié)構(gòu)域在外膜上形成一個選擇性通道來轉(zhuǎn)移α結(jié)構(gòu)域用于細(xì)胞外顯示，另一個α結(jié)構(gòu)域是自聚集的連接體。α結(jié)構(gòu)域之間的高親和力觸發(fā)自聚集，從而導(dǎo)致細(xì)胞沉淀。最近，有研究報道了Ag43的α結(jié)構(gòu)域復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。本研究則將Ag43結(jié)構(gòu)基因插入cpcG2啟動子PcpcG2的下游，利用綠光誘導(dǎo)調(diào)控其表達(dá)，通過在大腸桿菌中實現(xiàn)其發(fā)色團(tuán)合成基因盒表達(dá)和藍(lán)藻CcaS／CcaR的功能性表達(dá)。攜帶該系統(tǒng)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子在綠光照射下自聚集并沉淀，而缺乏綠光誘導(dǎo)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化子則沒有。綠光誘導(dǎo)系統(tǒng)在細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入固定生長階段之前就有效地發(fā)揮了作用，大約80％的細(xì)胞培養(yǎng)物通過簡單的修飾被恢復(fù)。

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所用到的主要方法

METHODS  

綠光誘導(dǎo)聚集系統(tǒng)編碼質(zhì)粒的構(gòu)建

多氯聯(lián)苯合成基因編碼質(zhì)粒的構(gòu)建

自聚集調(diào)節(jié)試驗

用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR對Ag43的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分析

細(xì)胞恢復(fù)評價

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文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

光傳感器可以作為一種新的遺傳工具。藍(lán)藻細(xì)菌擁有多種光感受器，其中之一為綠色可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，用于調(diào)控藍(lán)藻細(xì)菌的基因表達(dá)。然而，藍(lán)藻光感受器的應(yīng)用并不局限于其本身，還可以通過將藍(lán)藻發(fā)色團(tuán)與藍(lán)藻的光敏系統(tǒng)的共表達(dá)用于其它非光合微生物。比如一種基于抗原43（Ag43）的大腸桿菌衍生的自聚集系統(tǒng)，已被證明可以誘導(dǎo)多種細(xì)菌的細(xì)胞自聚集。本研究在一種大腸桿菌轉(zhuǎn)化株中，構(gòu)建了含有編碼Ag43結(jié)構(gòu)基因的綠光調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒PCC6803。將Ag43插入cpcG2啟動子PcpcG2的下游，通過綠光誘導(dǎo)調(diào)控其表達(dá)，使其發(fā)色團(tuán)合成基因盒表達(dá)和藍(lán)藻CcaS／CcaR在大腸桿菌中實現(xiàn)功能性表達(dá)。攜帶這種設(shè)計系統(tǒng)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子在綠光照射下自聚集并沉淀，而缺乏綠光誘導(dǎo)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化子則沒有。綠光誘導(dǎo)系統(tǒng)在細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入固定生長階段之前有效發(fā)揮作用，大約80％的細(xì)胞培養(yǎng)物通過簡單的修飾被恢復(fù)。本研究建立了一種針對細(xì)胞暴露于綠光誘導(dǎo)的非光合微生物的細(xì)胞恢復(fù)系統(tǒng)。該系統(tǒng)由一個來自藍(lán)藻細(xì)菌的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)控，細(xì)胞沉淀由一個自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ag43介導(dǎo)。為進(jìn)一步嚴(yán)格控制和提高細(xì)胞回收效率，該系統(tǒng)可以作為未來生物加工的一種新工具，減少細(xì)胞回收所需的能量和勞動力。

       原文標(biāo)題 : 一種針對非光合細(xì)菌的光調(diào)節(jié)性細(xì)胞恢復(fù)系統(tǒng)