可視化DNA損傷分析新技術(shù)揭示:氧化性DNA損傷在異染色質(zhì)和常染色質(zhì)中的修復(fù)方式是不同的
文章背景簡介
細(xì)胞呼吸、感染過程及化學(xué)、物理因子均可產(chǎn)生活性氧(ROS)。ROS會(huì)誘導(dǎo)DNA的堿基氧化及單鏈斷裂(SSBs),這種DNA損傷可被堿基切除/單鏈斷裂方式修復(fù)(BER/SSBR)。假如不修復(fù),ROS誘導(dǎo)的損傷就會(huì)阻礙DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定,從而產(chǎn)生突變,進(jìn)而驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生。BER和SSBR均通過DNA聚合酶修復(fù)形成長片段或短片段,在DNA連接酶III或DNA連接酶Ⅰ的作用下進(jìn)行連接。
在活細(xì)胞中,ROS誘導(dǎo)的DNA損傷可在時(shí)間和空間范圍內(nèi)進(jìn)行修復(fù),而染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對于DNA修復(fù)過程是至關(guān)重要的。利用含有旋轉(zhuǎn)定位尿嘧啶的重組核小體進(jìn)行的體外研究表明在染色質(zhì)損傷的情況下,BER酶的催化活性會(huì)受到抑制,ATP酶染色質(zhì)重構(gòu)因子SWI/SNF對8-oxoG BER的去除作用非常弱,說明染色質(zhì)重構(gòu)會(huì)促進(jìn)BER。
2013年,匹茲堡大學(xué)的Li Lan等人在《Nucleic Acids Research》(IF=11.561,生物1區(qū))發(fā)表了題為“Novel method for site-specific induction of oxidative DNA damage reveals differences in recruitment of repair proteins to heterochromatin and euchromatin”的文章。本文使用特異性的熒光蛋白KillerRed (KR),在活細(xì)胞的特定基因位置產(chǎn)生ROS誘導(dǎo)的氧化損傷。利用這種基于活化KR生成ROS的潛在機(jī)制,研究開發(fā)了一個(gè)可視化實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),通過將tetR-KR或TA-KR定位表達(dá)在人類細(xì)胞中特定的常染色質(zhì)或異染色質(zhì)位點(diǎn)上,從而可以實(shí)時(shí)觀察BER酶在特定位點(diǎn)的募集情況。
所用到的主要方法
1、熒光原位雜交;
2、染色質(zhì)免疫共沉淀;
3、乙炔基尿苷滲入檢測RNA合成;
4、流式細(xì)胞術(shù);
5、KR 激活;
6、細(xì)胞存活(MTT和菌落形成測定)
文章主要內(nèi)容摘要
活性氧(ROS)誘導(dǎo)的DNA損傷可以通過堿基切除修復(fù)途徑進(jìn)行修復(fù)。但染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對損傷位點(diǎn)BER蛋白的募集影響尚不清楚。為了解決這個(gè)問題,本研究開發(fā)了一種新方法,將光刺激產(chǎn)生ROS的誘導(dǎo)因子KillerRed (KR)與tet-阻遏因子(tetR-KR)或轉(zhuǎn)錄激活因子(TA-KR)融合,特異性地產(chǎn)生ROS,誘導(dǎo)DNA損傷。在U2OS細(xì)胞中,TetR-KR或TA-KR分別與90kb的TRE結(jié)合,整合在特定的基因組位點(diǎn),誘導(dǎo)異染色質(zhì)或常染色質(zhì)中ROS的損傷。研究發(fā)現(xiàn)在異染色質(zhì)和常染色質(zhì)中,DNA糖苷酶可有效地募集到DNA損傷位點(diǎn),PARP1則更有效募集到濃縮染色質(zhì)中,相反,F(xiàn)EN1募集到活性染色質(zhì)的DNA損傷位點(diǎn),并且以PCNA-和轉(zhuǎn)錄激活依賴的方式高度富集。這些結(jié)果表明,氧化性DNA損傷在異染色質(zhì)或常染色質(zhì)中的修復(fù)方式是不同的。
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