內(nèi)酯水解酶重組羅伊氏乳桿菌可有效降解玉米赤霉烯酮毒素
01
文章背景簡介
BACKGROUND INTRODUCTION
真菌毒素是絲狀真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,可在田間以及收獲、運(yùn)輸、加工或儲(chǔ)存期間污染農(nóng)作物。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(糧農(nóng)組織)估計(jì),世界上25%的以作物為基礎(chǔ)的農(nóng)產(chǎn)品會(huì)受到真菌毒素污染,導(dǎo)致全球每年大約損失1億噸糧食。玉米赤霉烯酮(ZEN)是鐮刀菌真菌產(chǎn)生的一種類雌激素真菌毒素,是食品和飼料中最常見的真菌毒素之一。ZEN可以激活雌激素受體,會(huì)導(dǎo)致農(nóng)場動(dòng)物的生殖障礙,偶爾也會(huì)導(dǎo)致人類出現(xiàn)高雌激素綜合征。因此,ZEN不僅會(huì)造成牲畜生產(chǎn)效率較低而引起重大經(jīng)濟(jì)損失,而且會(huì)對食用受ZEN污染食物的人構(gòu)成健康風(fēng)險(xiǎn)。減少ZEN健康風(fēng)險(xiǎn)的理想解決方案是避免食品和飼料中的ZEN污染。然而,這在目前的農(nóng)業(yè)實(shí)踐卻難以做到。因此,對已經(jīng)被ZEN污染的農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行解毒處理是另一種不錯(cuò)的選擇。食品和飼料中ZEN的去除方法包括化學(xué)方法,如將含有ZEN的食品暴露于臭氧或過氧化氫中;物理方法,如擠壓加工;生物方法,如使用生物轉(zhuǎn)化劑將ZEN降解為無毒代謝產(chǎn)物或使用吸附劑降低其生物利用度。 在這些ZEN解毒方法中,生物方法更為可取,因?yàn)樯锓ǹ梢栽跍睾蜅l件下去除真菌毒素,不必使用有害化學(xué)物質(zhì),也不會(huì)造成食品和飼料營養(yǎng)價(jià)值和適口性的重大損失。
zhd101是一種由Clonostachys rosea菌產(chǎn)生的內(nèi)酯酶,它能將ZEN轉(zhuǎn)化為酮類物質(zhì),這是一種毒性明顯較低的產(chǎn)品。在以前的研究中,zhd101已在大腸桿菌、釀酒酵母和水稻植株中成功表達(dá),由這些轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)生的重組zhd101可有效降解ZEN。
益生菌一直被用作飼料添加劑,因?yàn)樗鼈冇惺鼓c道微生物群正;,增強(qiáng)免疫系統(tǒng),預(yù)防腹瀉,提高飼料轉(zhuǎn)化效率等功能。雖然益生菌發(fā)揮了許多有益的作用,但有人推測,它們的特性可以通過遺傳修飾得到進(jìn)一步改善。羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)是動(dòng)物腸道菌群中常見的潛在益生菌之一。Lactobacillus reuteri Pg4最初是從健康肉雞的胃腸道中分離出來的,已被證明能夠耐受酸、鹽和膽汁,抑制病原體生長,并能粘附粘蛋白和粘液。此外,Lactobacillus reuteri Pg4已被用于異源表達(dá)一些纖維分解酶,包括β-葡聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶等。重組Lactobacillus reuteri Pg4菌株已被證明能夠在不損失其益生菌特性的情況下分解纖維。
2017年4月24日,臺(tái)灣大學(xué)生物技術(shù)研究所Wen?Chun Yang等人在《Microbial Cell Factories》雜志(IF2017=3.831,生物工程與應(yīng)用微生物2區(qū))上發(fā)表了題為“Expression of the Clonostachys rosea lactonohydrolase gene by Lactobacillus reuteri to increase its zearalenone-removing ability”的文章。在該研究中,作者介紹了zhd101基因在Lactobacillus reuteri Pg4中的異源表達(dá),并檢測了重組菌中異源酶的產(chǎn)生、酸和膽鹽耐受性以及粘附能力。
02
所用到的主要方法
METHODS
1、反轉(zhuǎn)錄聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-RT-PCR
2、蛋白質(zhì)印記分析-WB
3、高效液相色譜-HPLC
4、耐酸耐膽鹽
5、細(xì)胞粘附性實(shí)驗(yàn)
03
文章主要內(nèi)容摘要
ABSTRACT
在以前的研究中,本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)Lactobacillus reuteri Pg4表達(dá)纖維溶解酶,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的Lactobacillus reuteri菌株獲得了分解植物纖維的能力,從而導(dǎo)致肉雞體重增加、飼料轉(zhuǎn)化效率提高。本研究將zhd101基因?qū)氲絃actobacillus reuteri Pg4中,轉(zhuǎn)化菌株Lactobacillus reuteri pNZ-zhd101成功表達(dá)了zhd101,獲得了降解ZEN的能力。據(jù)我們所知,這是第一次報(bào)告成功表達(dá)ZEN降解酶的腸道乳酸桿菌。
在含有4.5 mg/L ZEN的MRS肉湯中培養(yǎng)3株Lactobacillus reuteri 14小時(shí)后,發(fā)現(xiàn)Lactobacillus reuteri pNZ-zhd101肉湯中的ZEN濃度下降了99.3%。Takahashi-Ando等人發(fā)現(xiàn)從大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組zhd101在低于4.5的pH值下會(huì)發(fā)生不可逆地失活。為此,本實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵過程中將Lactobacillus reuteri pNZ-zhd101培養(yǎng)基的pH值維持在7.0,發(fā)現(xiàn)Lactobacillus reuteri pNZ-zhd101在這種培養(yǎng)條件下可以有效地去除ZEN。這些結(jié)果表明:由Lactobacillus reuteri pNZ-zhd101產(chǎn)生的重組zhd101在pH7.0下呈活性形式。通常而言,豬小腸、盲腸和結(jié)腸的平均ph值分別為6.5、6.1和6.5,雞的作物、小腸、盲腸和結(jié)腸的平均ph值分別為6.1、6.4、6.4和6.6。由于這些動(dòng)物腸道環(huán)境均呈弱酸性至中性,研究者認(rèn)為Lactobacillus reuteri pNZ-zhd101產(chǎn)生的重組zhd101可以以活性形式直接輸送到腸道。
在之前的一項(xiàng)研究中,我們觀察到Lactobacillus reuteri Pg4在體外對酸性條件和膽汁鹽接觸具有抵抗力。在本研究中,所有三株Lactobacillus reuteri Pg4菌株在pH3.0下培養(yǎng)4小時(shí)后或在含有0.5%牛膽的MRS肉湯中培養(yǎng)24小時(shí)后均存活。此外,在酸性條件下或膽汁鹽存在下,Lactobacillus reuteri 轉(zhuǎn)化菌株的細(xì)菌計(jì)數(shù)與Lactobacillus reuteri Pg4的細(xì)菌計(jì)數(shù)沒有差異。這些結(jié)果表明:Lactobacillus reuteri Pg4菌株可以通過胃運(yùn)輸存活下來,并可能在腸道環(huán)境中存活,在那里它們可以有效工作。
Caco-2細(xì)胞系已廣泛用于益生菌體外黏附能力的評價(jià)。在這項(xiàng)研究中,將熒光標(biāo)記的Lactobacillus reuteri pNZ-zhd101與Caco-2細(xì)胞孵育2h后,分析顯示Lactobacillus reuteri 細(xì)胞能粘附在Caco-2細(xì)胞上,而目前已證實(shí)益生菌可以與致病細(xì)菌競爭腸道上皮細(xì)胞上相同的結(jié)合位點(diǎn)。此外,重組益生菌分泌的特異性酶附著在小腸上皮細(xì)胞上,可直接作用于小腸消化道中的底物,在小腸消化道中可吸收大部分ZEN。因此,Lactobacillus reuteri pNZ-zhd101粘附腸道粘膜細(xì)胞的能力延長了其在腸道中的停留時(shí)間,從而使其達(dá)到最大益生菌效果。
總的來說,本實(shí)驗(yàn)成功地在Lactobacillus reuteri 菌株中克隆了水解酶基因zhd101,并檢測確證該異源zhd101可在轉(zhuǎn)化株Lactobacillus reuteri pNZ-zhd101中實(shí)現(xiàn)功能性的表達(dá)。異源蛋白zhd101的產(chǎn)生并不影響菌株的生長、耐酸耐膽鹽性,對Lactobacillus reuteri pNZ-zhd101的粘附能力影響較小。因此,我們認(rèn)為Lactobacillus reuteri pNZ-zhd101有可能作為益生菌飼料添加劑用于ZEN的降解。
▼相關(guān)鏈接▼解毒毛孢酵母可將玉米赤霉烯酮降解為無雌激素活性的代謝產(chǎn)物
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