高效CRISPR-Cas9介導酵母多重基因組編輯
文章背景簡介
耐熱的漢遜酵母Ogataea polymorpha是一種具有基礎(chǔ)研究和應(yīng)用價值的微生物。它已成為研究甲醇利用、細胞自噬、硝酸同化的重要有機體。它的一個吸引人的特性是能夠通過非同源末端連接(NHEJ)將多達100個目標拷貝基因整合到基因組中。此外,它可以利用人體低聚糖合成糖蛋白,還可以在高達50℃的溫度下生長,從而可降低工業(yè)發(fā)酵昂貴的冷卻成本。
CRISPER-Cas9輔助基因組編輯技術(shù)的研究進展為建立多重基因組工程提供了一種有效的途徑。其基本原理是:反式激活crRNA:crRN雙鏈直接引導Cas9蛋白與目標DNA序列結(jié)合,然后Cas9蛋白在PAM上游的三個核苷酸中產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)。DSB可以通過非同源末端連接插入或修復(fù),也可以通過同源重組來進行精準編輯,如基因敲除,點突變等。
核糖體DNA(rDNA)是編碼核糖體RNA的DNA序列。在酵母中,rDNA通常由大量的相同重復(fù)序列組成。在O. polymorpha中,rDNA包含50-60個8kb的重復(fù)單元。在釀酒酵母(S. cerevisiae)中,rDNA位點由150-200個重復(fù)序列組成,重復(fù)序列為9.1kb。近年來,rDNA重復(fù)序列已成為一些酵母菌多拷貝基因整合的目標位點。
2018年6月,中國科學院微生物學研究所病原微生物學與免疫學重點實驗室的Laiyou Wang等人,在《Biotechnology for Biofuels》雜志(IF2018=5.497;工程技術(shù) 1區(qū))發(fā)表了題為“Efficient CRISPR-Cas9 mediated multiplex genome editing in yeasts”的文章。
所用到的主要方法
1.活細胞的制備及轉(zhuǎn)化
2.質(zhì)粒構(gòu)建和模板編輯
3.編輯效率計算:
編輯效率=所需突變體數(shù)目/總被測菌落數(shù)
4.流式細胞儀分析
5.基因拷貝數(shù)估計
6.穩(wěn)定性檢測
7.搖瓶發(fā)酵
8.產(chǎn)品濃度分析:HPLC
文章主要內(nèi)容摘要
在本研究中,作者發(fā)展了一種CRISPR-Cas9輔助多重基因組編輯(CRISPR–Cas9-assisted multiplex genome editing,CMGE)方法,包括多重基因敲除、多位點(ML)和多拷貝(MC)整合方法。在CMGE的基礎(chǔ)上,對漢遜酵母(O.polymorpha)進行了基因敲除、整合和精確點突變等基因組修飾。采用CMGE-ML整合方法,在白藜蘆醇生物合成途徑三個不同的位點同時整合 橙色滑柱菌(Herpetosiphon aurantiacus)的酪氨酸解氨酶(TAL)基因,擬南芥的4-香豆酰CoA連接酶(4CL)基因和釀酒葡萄的芪合酶(STS)基因,成功實現(xiàn)白藜蘆醇在O. polymorpha內(nèi)的生物合成。采用CMGE-MC方法,將不同拷貝數(shù)的融合基因表達盒Psctef1-TAL-Psctpi1-4CL-Psctef2-STS整合到基因組中,白藜蘆醇產(chǎn)量比單拷貝整合提高了20倍,達到97.23±4.84 mg/L。此外,本研究還利用CMGE-MC技術(shù)分別整合了人血清白蛋白(HSA)和大腸桿菌賴氨酸脫羧酶(cadA)基因,實現(xiàn)了人血清白蛋白和尸胺的生物合成。除漢遜酵母外,本研究還在釀酒酵母內(nèi)也成功地建立了 CMGE-MC方法。CMGE方法為O. polymorpha和其他酵母的基因工程和合成生物學研究提供了一個有效的工具。
在釀酒酵母中同步敲除多基因的CRISPR-Cas系統(tǒng)
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