2019年5月，由劍橋創(chuàng)新學(xué)院（Cambridge Innovation Institute）主辦的第七屆歐洲分子診斷大會在葡萄牙首都里斯本召開。來自全球各地的400多名與會者在這里一同分享分子診斷領(lǐng)域的最新進(jìn)展和研究成果。歐洲分子診斷大會是全球最有影響力的分子診斷學(xué)大會之一，包括有七個分會、兩個短課程、十二個圓桌討論和大量壁報展示，涵蓋了產(chǎn)前分子診斷、免疫療法生物標(biāo)志物、液體活檢、即時檢測等多個熱門領(lǐng)域。

本次大會上，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院的施奇惠教授作為唯一受邀的內(nèi)地演講者，發(fā)表了主題為“Metabolic Phenotyping and Single－Cell Sequencing of Circulating Tumor Cells in Non－Small Cell Lung Cancer（非小細(xì)胞肺癌中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的代謝表型和單細(xì)胞測序）”的演講。

動脈新醫(yī)藥在施奇惠教授回國后第一時間與他取得了聯(lián)系，并進(jìn)行了采訪。施奇惠教授為我們分享了本次的參會情況以及他對分子診斷領(lǐng)域的見解。

聚焦CTC：用單細(xì)胞測序驗證準(zhǔn)確性很關(guān)鍵

施奇惠教授

CTC（循環(huán)腫瘤細(xì)胞）一直是施奇惠的主要研究對象之一。本次參會發(fā)表的演講內(nèi)容也是基于他近期在CTC代謝分型上的研究成果。該項研究成果反映了施奇惠教授團(tuán)隊的最新進(jìn)展，揭示了CTC在代謝上的異質(zhì)性，并發(fā)現(xiàn)根據(jù)不同代謝表型的CTC比例可以預(yù)測患者的治療反應(yīng)、臨床表現(xiàn)和生存率。

施奇惠教授認(rèn)為，CTC與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性比較強(qiáng)。CTC在腫瘤早篩中的應(yīng)用重點不應(yīng)是在早期發(fā)現(xiàn)癌癥，而是在早期發(fā)現(xiàn)已經(jīng)轉(zhuǎn)移的癌癥。

“一般情況下，早期的腫瘤很少會釋放CTC到血液當(dāng)中。但如果腫瘤本身侵襲性很強(qiáng)，那么即使腫瘤本身很小，也可能在很早期就能從血液中檢測到CTC。這種情況下用CTC進(jìn)行早篩是有意義的�！笔┢婊菡f。他認(rèn)為CTC除了預(yù)后、用藥指導(dǎo)以外，更重要的應(yīng)用方向是用于患者分層或者說輔助分期，協(xié)助目前的影像學(xué)手段區(qū)分轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的腫瘤和轉(zhuǎn)移能力弱的腫瘤，從而幫助患者和醫(yī)生及時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的腫瘤，制定后續(xù)的治療方案。

“CTC主要能從兩方面提供信息，一方面是數(shù)目，另一方面是分子特征。分子特征包括了基因信息和蛋白信息。CTC數(shù)目與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系現(xiàn)在還尚不明確，目前主要用于預(yù)后，暫時還無法用于判斷患者是否已經(jīng)發(fā)生了血行轉(zhuǎn)移，或是已有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。但我們可以確定的是，CTC本身也是具有異質(zhì)性的，如果能夠用特定的分子靶標(biāo)對CTC進(jìn)行再分型的話，將來可能將CTC在不同子群中的分布情況與腫瘤患者的轉(zhuǎn)移情況直接聯(lián)系起來。”施奇惠說。

CTC的臨床價值毋庸置疑。Clinicaltrials．gov顯示，全球注冊的液體活檢臨床試驗中，有關(guān)CTC的臨床試驗一直多于ctDNA。施奇惠告訴我們，CTC領(lǐng)域研究的難點在于CTC相關(guān)研究的技術(shù)路線紛繁復(fù)雜。不同的技術(shù)路線可能會捕捉到不同純度水平的CTC，也可能會捕捉到不同的CTC子群。這就導(dǎo)致了通過不同技術(shù)路線獲得的CTC數(shù)據(jù)很難直接進(jìn)行比較。

CTC的臨床試驗中廣泛使用到的是15年前上市的CellSearch平臺。CellSearch平臺由強(qiáng)生公司開發(fā)，通過EpCAM（上皮細(xì)胞黏附分子）富集CTC細(xì)胞。這一平臺雖然穩(wěn)定性好，但在一些癌癥（如非小細(xì)胞肺癌）中靈敏度較低，即使是在晚期腫瘤患者樣本中，檢出率也并不高。

施奇惠告訴我們，這種靈敏度低可能并不是技術(shù)原因造成的。將已知給定數(shù)目的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞系混入健康人的血液中再通過該平臺檢測，腫瘤細(xì)胞的回收率很高。他推測檢出率低更可能與生物學(xué)原因有關(guān)。比如有部分CTC經(jīng)過EMT（上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化）之后，上皮標(biāo)志物表達(dá)量降低同時細(xì)胞變形能力增強(qiáng)。這部分細(xì)胞會很難被CellSearch平臺檢測到。

“在這樣的情況下，在CTC研究中使用單細(xì)胞測序就顯得很有必要了。血液中的CTC數(shù)目一定是有研究價值的。但要對其價值進(jìn)行挖掘，關(guān)鍵的一點是要驗證獲取到的每一個CTC都的確是腫瘤細(xì)胞。這時候就需要對每個被捕獲的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測序�！笔┢婊菡f。

在施奇惠教授看來，由于單細(xì)胞測序的成本和檢測復(fù)雜程度，這項技術(shù)直接應(yīng)用于臨床挑戰(zhàn)也不小。單細(xì)胞測序已經(jīng)普遍應(yīng)用于CTC的基礎(chǔ)研究中，比如幫助檢驗用于分選CTC的生物標(biāo)志物的準(zhǔn)確性，證明用該生物標(biāo)志物分選出的CTC確實都是腫瘤細(xì)胞。當(dāng)生物標(biāo)志物經(jīng)過長期的檢測獲得了普遍的認(rèn)可之后，后續(xù)在科研和臨床上的應(yīng)用過程就不再需要長期使用單細(xì)胞測序的科研方法來驗證了。

液體活檢接入免疫治療大有可為

在腫瘤液體活檢中，與CTC檢測同樣重要的就是ctDNA（循環(huán)腫瘤DNA）檢測。相比之下，ctDNA目前的進(jìn)展較快，也更貼近臨床。施奇惠認(rèn)為其主要原因是ctDNA的檢測對象更清晰（如點突變和甲基化），技術(shù)路徑也比較直接，實現(xiàn)起來更方便。

不僅如此，ctDNA不像CTC會受到自身異質(zhì)性的影響，即使使用不同的方法檢測到的內(nèi)容基本也是一致的，結(jié)果的可比性較強(qiáng)。

施奇惠說：“目前ctDNA研究有兩個熱門方向，一是通過TMB（腫瘤突變負(fù)荷）來預(yù)測免疫治療療效，二是癌癥的早期篩查。在早篩應(yīng)用上，ctDNA還有幾個難點要克服。比如早期患者的ctDNA濃度過低，很容易受到其他來源的具有突變的cfDNA（游離DNA）的干擾。另外，器官定位也是當(dāng)前ctDNA早篩應(yīng)用中的一大難點�！�

隨著細(xì)胞治療和抗體藥物走入臨床，免疫治療在腫瘤治療領(lǐng)域中的熱度迅速躥升。目前已經(jīng)在腫瘤組織的相關(guān)研究中證明，TMB和PD－L1是預(yù)測PD－1／PD－L1免疫抑制劑療效的獨立生物標(biāo)志物，可以用于為免疫治療提供伴隨診斷。

在組織樣本檢測中，精準(zhǔn)病理可以通過多種方法獲取豐富的腫瘤－免疫相互作用的信息。但是由于臨床上難以多次進(jìn)行組織活檢，液體活檢就有機(jī)會在跟蹤指導(dǎo)免疫治療的過程中發(fā)揮巨大作用。

據(jù)了解，臨床上已經(jīng)能夠通過血液中的ctDNA檢測bTMB（血液TMB）。施奇惠告訴我們，CTC也可以用于檢測腫瘤細(xì)胞PD－L1的表達(dá)，但是其與原位的一致性還未得到驗證�！巴ㄟ^檢測患者血液中的新抗原特異性、處于激活狀態(tài)的CD8＋ T細(xì)胞，也可以對免疫治療的效果進(jìn)行預(yù)判�！彼�說，“這也屬于廣義上的液體活檢�！�

胎兒細(xì)胞檢測（Cell－based NIPT）可能成為NIPT領(lǐng)域的新藍(lán)海

對于國內(nèi)熱門的NIPT（無創(chuàng)產(chǎn)前診斷）領(lǐng)域，施奇惠也有自己的看法。NIPT在國內(nèi)已經(jīng)形成了一片初具規(guī)模的市場，并帶動了一波基因檢測行業(yè)的風(fēng)潮。但是施奇惠教授認(rèn)為，NIPT領(lǐng)域還有更大的發(fā)展空間。

“現(xiàn)在NIPT主要檢測的是以唐氏綜合征為代表的染色體多倍體綜合征，但這些在整個染色體畸變、基因突變等所導(dǎo)致的出生缺陷中只占很小一部分。NIPT在出生缺陷篩查上還有很多機(jī)會可去挖掘�！彼�說。

目前NIPT主要檢測的是血液中的游離胎兒DNA。施奇惠則認(rèn)為胎兒細(xì)胞在NIPT（cell－based NIPT）中也有很好的發(fā)展前景，但實現(xiàn)前提是找到合適的方法來獲得盡量多、盡量純的胎兒細(xì)胞。他認(rèn)為，胎兒細(xì)胞包含完整的基因組，因此基于胎兒細(xì)胞的檢測有潛力為產(chǎn)前診斷提供通用的解決方案。

目前這一方面的研究主要聚焦于血液中的胎兒有核紅細(xì)胞與滋養(yǎng)層細(xì)胞，以及孕婦宮頸粘液中的滋養(yǎng)層細(xì)胞。其中血液中的胎兒細(xì)胞數(shù)目稀少，而宮頸粘液中則有較多的胎兒細(xì)胞。

“胎兒細(xì)胞現(xiàn)在的發(fā)展和CTC的情況很類似，如何有效的鑒別、分離以及測序胎兒細(xì)胞是一個比較大的問題，甚至對于胎兒細(xì)胞的技術(shù)要求更高。因為對于胎兒細(xì)胞，單純計數(shù)沒有臨床意義，必須進(jìn)行測序。因此，我們不僅要找到合適的鑒別胎兒細(xì)胞的生物標(biāo)志物，還要充分的加以驗證。在標(biāo)志物驗證的階段有必要對每個目標(biāo)細(xì)胞都進(jìn)行單細(xì)胞測序，驗證其胎源性。”施奇惠說。

施奇惠告訴我們，在胎兒細(xì)胞檢測中面臨的另一個問題是單細(xì)胞測序質(zhì)量較差，尚不足以形成可靠的診斷。與CTC不同，對胎兒細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)并沒有明確的臨床意義，因此測序是胎兒細(xì)胞檢測不可或缺的組成部分。

但胎兒細(xì)胞數(shù)目稀少，單細(xì)胞測序是目前胎兒細(xì)胞檢測中的最佳選項。而目前的檢測流程較長，包括了細(xì)胞的固定染色分離以及單細(xì)胞基因組擴(kuò)增，容易產(chǎn)生基因的偏向性和錯誤，還需進(jìn)一步優(yōu)化。因此目前胎兒細(xì)胞單細(xì)胞測序仍處在臨床前的研究階段。

隨著無創(chuàng)產(chǎn)前診斷與宮內(nèi)基因編輯技術(shù)的進(jìn)展，未來我們將能夠更早的發(fā)現(xiàn)出生缺陷并給予治療。

2020年ISMRC將在上海召開，助力中國液體活檢領(lǐng)域與世界接軌

促進(jìn)國內(nèi)液體活檢領(lǐng)域與國際一流專家、和最新研究的交流，也是施奇惠教授長期關(guān)注的重點。由“Liquid Biopsy（液體活檢）”概念最早的提出人，德國漢堡大學(xué)的Klaus Pantel教授發(fā)起，已經(jīng)召開了20多年的ISMRC會議（International Symposium on Minimal Residual Cancer）是全球液體活檢領(lǐng)域歷史最長、最有影響力的學(xué)術(shù)會議。

施奇惠教授、上海胸科醫(yī)院陸舜教授與Klaus Pantel教授合作，將第12屆ISMRC（第一屆全球液體活檢大會）首次引進(jìn)中國，計劃于2020年10月在上海召開。屆時，全球液體活檢領(lǐng)域，尤其是CTC、ctDNA和免疫治療伴隨診斷等多個液體活檢領(lǐng)域的近百位全球一流專家將匯聚中國，以促進(jìn)液體活檢的發(fā)展和轉(zhuǎn)化，助力中國液體活檢研究和應(yīng)用與全球接軌，將更多的中國液體活檢成果推向這一世界一流的創(chuàng)新平臺。

文 ｜ 郝翰

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