前言

現(xiàn)代免疫療法作為癌癥治療的一個新里程碑，帶來了革命性的改變，以前由于缺乏治療選擇而受到限制的許多腫瘤類型得到了改善。這反映在隨后的一系列免疫腫瘤學(xué)（IO）藥物的獲批。在實體瘤中，大多數(shù)成功的案例都是通過免疫檢查點抑制劑（ICIs）實現(xiàn)的，但其他的免疫療法仍在開發(fā)中。一種很有前途的方法是通過腫瘤靶細(xì)胞抗原和T細(xì)胞表面分子的同時作用，使T細(xì)胞重新定向和募集，從而激活多克隆細(xì)胞毒性T細(xì)胞，并最終導(dǎo)致腫瘤溶解。這種新概念的T細(xì)胞接合器（TCE）包括基因工程過繼細(xì)胞療法（GE－ACT）和雙特異性抗體（BsAb）。

過繼細(xì)胞療法包括給予病人自己的免疫細(xì)胞，這些細(xì)胞已經(jīng)在體外用改良的T細(xì)胞受體（TCR）或嵌合抗原受體（CAR）進(jìn)行了修飾。雙特異性抗體是由兩個相互連接的抗體結(jié)合區(qū)組成的重組蛋白，能夠同時識別兩個抗原，一個位于腫瘤細(xì)胞表面，另一個抗原是TCR的共同組成部分，充當(dāng)腫瘤和T細(xì)胞的橋接劑，并使TCR觸發(fā)靶向T細(xì)胞定向攻擊腫瘤細(xì)胞。

TCE在一些血液學(xué)癌癥中顯示出了極好的效果，到目前為止，已經(jīng)有三種CD19靶向TCE，兩種CAR－T細(xì)胞和一種BsAb，由食品和藥物管理局（FDA）和歐洲藥品管理局批準(zhǔn)。然而，實體瘤有完全不同的分子、物理和環(huán)境障礙，尤其是缺乏真正特異的表面腫瘤抗原，使TCE在實體瘤上的應(yīng)用面臨極大挑戰(zhàn)。

TCEs的作用機(jī)制

TCEs的活性主要取決于TCR激活的不同策略。天然TCR／分化簇3（CD3）是一種八聚體蛋白復(fù)合物，由具有固定化學(xué)計量比的異二聚體和同二聚體組成：CD3γ／CD3ε、CD3δ／CDε、CD3ζ／CD3ζ和CD3α／CD3β，CD3α／CD3β負(fù)責(zé)識別由主要組織相容性復(fù)合體（MHC）遞呈的多肽片段，而其余單位將通過免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）促進(jìn)級聯(lián)激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性顆粒酶和穿孔素釋放，以及不同的細(xì)胞因子和趨化因子，導(dǎo)致額外的T細(xì)胞募集和增殖。

大多數(shù)BsAb通過抗體結(jié)合區(qū)同時連接腫瘤細(xì)胞抗原和TCR的CD3ε亞基，從而繞過MHC限制，促進(jìn)細(xì)胞毒性。BsAb可分為兩個亞型：不含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的小片段形式和免疫球蛋白G（IgG）樣BsAb。大多數(shù)類似IgG的BsAb含有一個工程化的Fc結(jié)構(gòu)域，旨在維持Fc受體（FcRn）的結(jié)合，以提高其半衰期和穩(wěn)定性。

基因工程化的TCR將腫瘤相關(guān)抗原（TAA）識別為天然的生物途徑，即通過CD3α／CD3β激活，因此需要MHC呈遞。TCR－T對細(xì)胞內(nèi)和膜表面抗原都能被識別，這使得靶點范圍更廣。CAR－T細(xì)胞不依賴于MHC；其嵌合結(jié)構(gòu)包含一個單鏈可變片段（scFv）作為抗原結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域，其中一個鉸鏈區(qū)、一個跨膜區(qū)和一個負(fù)責(zé)T細(xì)胞活化的胞內(nèi)CD3ζ鏈。新一代的CAR－T不僅包括激活域，還包括共刺激分子和細(xì)胞因子表達(dá)。總之，BsAb和CAR－T細(xì)胞CD3的激活依賴于抗體結(jié)合區(qū)介導(dǎo)的抗原識別，而TCR－T細(xì)胞則需要腫瘤抗原的MHC呈遞才能被激活。

TCE在實體瘤治療中的臨床表現(xiàn)

TCEs的抗腫瘤活性：

TCEs的臨床發(fā)展是一個不斷挑戰(zhàn)實體瘤的過程。2006年，MART－1 TCR－T細(xì)胞對黑色素瘤患者顯示出良好的耐受性，并且在兩名患者中觀察到工程細(xì)胞的持續(xù)存在和疾病的客觀響應(yīng)，人們因此對GE－ACTs的期望上升。幾年后，catumaxomab在歐盟被批準(zhǔn)用于治療惡性腹水。這種CD3抗EpCAM的三功能抗體在II／III期試驗中得到證實，以減少穿刺的需要。然而，2017年因商業(yè)原因撤回了該藥。2010年，CD19導(dǎo)向CAR－T細(xì)胞首次成功用于急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL），并同時促進(jìn)了針對實體瘤的研究。不幸的是，在這一領(lǐng)域，很快觀察到一個臨床的黑暗面，多個試驗不得不停止招募，因為致命的毒性和缺乏足夠的抗腫瘤活性。人們因此將臨床研究轉(zhuǎn)向更好和更具體的目標(biāo)，導(dǎo)致第二波TCE的研究浪潮，并取得了更好的結(jié)果。

在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，直接靶向GD2神經(jīng)節(jié)苷脂的下一代CAR－T細(xì)胞顯示出3個患者的完全反應(yīng)。同樣，HER2表達(dá)肉瘤的I／II期試驗發(fā)現(xiàn)HER2－CAR－T細(xì)胞具有臨床療效，耐受性良好。另外兩個CAR－T細(xì)胞也顯示出令人鼓舞的結(jié)果；在間皮瘤患者中，經(jīng)胸膜內(nèi)注射導(dǎo)向間皮細(xì)胞的CAR－T的客觀反應(yīng)率為41％。有趣的是，這些患者的外周血中也檢測到CAR－T細(xì)胞。第二個為自體CAR－CLDN18．2－T細(xì)胞治療CLDN 18．2陽性胃或胰腺腫瘤，其反應(yīng)率為36％。

2017年，第一個轉(zhuǎn)基因NY－ESO TCR－T細(xì)胞在滑膜肉瘤患者中的響應(yīng)率高達(dá)50％，并且CRS可控。NY－ESOTCR－T細(xì)胞同樣在脂肪肉瘤患者中也達(dá)到了50％的響應(yīng)率（4／8）。2019年，MAGE－A4 TCR－T細(xì)胞在晚期滑膜肉瘤患者中也報告了類似的響應(yīng)率。

最近，另外兩個TCR－T早期試驗報告了富有前景的結(jié)果。一個靶點是人乳頭瘤病毒（HPV）陽性相關(guān)上皮癌的E7腫瘤蛋白。在此項研究的12名重度治療的患者中，有6名在研究的三個劑量水平上獲得持久的部分響應(yīng)。另一種是ADPA2M4 SPEAR TCR－T細(xì)胞治療MAGE－A4陽性腫瘤，在治療的38例患者中，疾病控制率約為90％，確定的44％的部分響應(yīng)在滑膜肉瘤、肺癌、頭頸癌等腫瘤中均有報道。大多數(shù)毒性與淋巴細(xì)胞衰竭有關(guān)，但兩例患者發(fā)生致命后果。

關(guān)于BsAb，2014年，blinatumomab成為第一個被FDA批準(zhǔn)的BsAb，目前用于治療ALL患者。同時，cibisatamab作為單藥或聯(lián)合atezolizumab治療微衛(wèi)星穩(wěn)定性大腸癌患者的I期研究結(jié)果顯示，有效率分別為6％和18％。安進(jìn)目前正在開發(fā)兩種半衰期延長的BsAb，AMG199用于MUC17陽性胃和胃食管交界處腫瘤，AMG757用于DLL3陽性小細(xì)胞肺癌。此外，有各種各樣的臨床試驗在不同的適應(yīng)癥下進(jìn)行。

T細(xì)胞驅(qū)動的毒性：

TCEs可能導(dǎo)致多種不同的毒性。T細(xì)胞輸注前給予氟達(dá)拉濱和環(huán)磷酰胺的淋巴衰竭化療，隨后導(dǎo)致全血細(xì)胞減少和潛在的發(fā)熱性中性粒細(xì)胞減少癥，并報告了一些致命病例。

細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）是一種與TCE相關(guān)的不良事件（AE），大多為抗原依賴性的，表現(xiàn)為大量釋放促炎性細(xì)胞因子（IL－6、TNF－α、IFN－γ、IL－1）和炎癥標(biāo)志物（鐵蛋白、C－反應(yīng)蛋白）的反應(yīng)性增加，類似于膿毒血癥。患者出現(xiàn)發(fā)熱、肌痛、心動過速、低血壓、呼吸功能不全等癥狀，并可能導(dǎo)致死亡。循環(huán)中的細(xì)胞因子和趨化因子也能激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，能夠跨越血腦屏障。

GE－ACTs也與免疫效應(yīng)器細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（ICANS）有關(guān)，其定義為意識下降、意識混亂、癲癇發(fā)作和腦水腫，并不總是與全身性CRS一起出現(xiàn)。blinatumomab是一種CD3－CD19雙特異性T細(xì)胞接合器（BiTE），與臨床上無法與ICANS區(qū)分的神經(jīng)學(xué)AEs相關(guān)，并且與CRS的快速甚至有時致命的發(fā)展有關(guān)。使用cibisatamab，CEA－CD3的BsAb治療結(jié)直腸癌（CRC），高達(dá)24％的患者出現(xiàn)與CRS類似癥狀一致的嚴(yán)重輸液相關(guān)反應(yīng)（IRR）。

一般來說，CRS的嚴(yán)重程度可能與腫瘤負(fù)荷、注入的細(xì)胞數(shù)量或BsAb的起始劑量有關(guān)。逆轉(zhuǎn)這些癥狀的治療方法包括中和IL－6活性的解毒劑，Tocilizumab已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于治療CRS，而siltuximab還沒有得到充分的研究，其用途仍處于研究階段。此外，這些治療通常與皮質(zhì)類固醇聯(lián)合使用，有時還與其他免疫抑制劑聯(lián)合使用，如抗腫瘤壞死因子α（infliximab）或抗IL－1（anakinra）。

此外，TAA也在健康組織中表達(dá)，當(dāng)T細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞結(jié)合時，可能會出現(xiàn)“靶向非腫瘤”的毒性。例如，在MART－1和gp100的TCR－T治療黑色素瘤的研究中，這一現(xiàn)象導(dǎo)致嚴(yán)重皮疹、葡萄膜炎和耳毒性。

面臨的挑戰(zhàn)和有待改進(jìn)的區(qū)域

克服腫瘤對T細(xì)胞導(dǎo)向治療的耐藥性

迄今為止，與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的一些主要差異決定了TCE在實體瘤中的療效較低。比如，在實體瘤中很難找到像CD19這樣普遍表達(dá)的腫瘤標(biāo)志物，其次治療需要深入到腫瘤中，并且必須在復(fù)雜且具抑制性的腫瘤微環(huán)境中工作。這些因素都導(dǎo)致腫瘤對TCE的耐藥性。

首先，抗抗體（ADA）可能在TCE輸注后出現(xiàn)，由CD4 T淋巴細(xì)胞、記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞介導(dǎo)。藥物本身的結(jié)構(gòu)、外來序列的存在、劑量、給藥途徑和患者的免疫系統(tǒng)都與BsAb治療后產(chǎn)生的ADA有關(guān)，從而導(dǎo)致IRR、治療效果的潛在降低，并影響清除率以及藥代動力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)的變化。減少ADA形成的一個有趣的可能性是在BsAb給藥之前給予抗CD20抗體，如obinotuzumab，以消除B細(xì)胞活性。這一策略目前正在以TCE作為cibisatamab（NTC03866239）的研究中進(jìn)行探索。

其次，TCE需要恰當(dāng)?shù)胤植�。一些試驗正在考慮局部給藥，如腦（NCT04045847）或間皮瘤，而其他策略包括改善T細(xì)胞轉(zhuǎn)運，例如，表達(dá)CCL2或VEFGR2趨化因子受體的CAR－T細(xì)胞，以實現(xiàn)更好的分布。

第三，當(dāng)藥物到達(dá)腫瘤時，異質(zhì)性存在于所有表型特征；細(xì)胞形態(tài)、代謝、增殖表達(dá)、免疫原性和基因表達(dá)，包括細(xì)胞表面標(biāo)記物。確切地說，缺乏真正特異的腫瘤細(xì)胞表面抗原，并且可以用這些工程化的T細(xì)胞作為靶點，這是對實體瘤的GE－ACTs重定向方法的主要限制。這在B細(xì)胞或漿細(xì)胞惡性腫瘤中是不同的，在這些惡性腫瘤中，CD19、CD20或BCMA等特異性抗原可以作為靶點，并且可以容忍治療過程中正常B細(xì)胞或漿細(xì)胞的耗竭，事實上，一旦治療結(jié)束，藥物被清除，這些正常細(xì)胞就會從陰性靶向的前體中再生出來。腫瘤內(nèi)抗原密度的不均一性和腫瘤組織間抗原分布的變化使得精確治療的靶點難以確定。組合抗原識別方法，如雙特異性或三特異性CAR－T細(xì)胞，或相反，促進(jìn)表位擴(kuò)散或增加抗原表達(dá)，可能克服腫瘤異質(zhì)性。

腫瘤微環(huán)境的抑制是TCE失敗的另一個主要因素，因此，第四，TCE必須抵抗腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境不僅包括免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞，還包括低氧相關(guān)因子、壞死、營養(yǎng)缺乏和免疫抑制因子如PD－L1、IL－10或TGF－β。直接作用于成纖維細(xì)胞活化蛋白的CAR－T細(xì)胞，或表達(dá)乙酰肝素酶的CAR－T細(xì)胞，分別能創(chuàng)造更有利的環(huán)境和提高腫瘤的外顯率。對于BsAb來說，理論上，活性將取決于腫瘤周圍的T細(xì)胞的密度和種類，但它們是不可預(yù)測的，而且變化很大。已存在的具有耗竭表型的T細(xì)胞，或浸潤腫瘤的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能會阻礙BsAb的作用。

第五，具有完全活力的T細(xì)胞需要保持活躍和存活。精氨酸耗竭與增殖、存活和T細(xì)胞功能障礙有關(guān)。通過CAR基因構(gòu)建物恢復(fù)精氨酸水平可以改善這些功能。T細(xì)胞衰竭還與抑制性受體信號上調(diào)（即PD－1、TIM－3或LAG－3）以及腫瘤細(xì)胞中PD－L1的表達(dá)有關(guān)。結(jié)合TCEs和檢查點抑制劑，或T細(xì)胞PD－1基因編輯可以重建功能。此外，CAR－T細(xì)胞功能障礙與T細(xì)胞的非協(xié)調(diào)性持續(xù)激活導(dǎo)致凋亡、衰竭和抗腫瘤效應(yīng)受損有關(guān)，主要與CAR表達(dá)的靶點的結(jié)構(gòu)和種類有關(guān)�？s短體外擴(kuò)增方案，或使輸注產(chǎn)物在具有干細(xì)胞特性的T細(xì)胞中富集，可提高T細(xì)胞存活率。

最后一點是克服逃避的機(jī)制�？乖�表達(dá)缺失是一種對CAR－T細(xì)胞的適應(yīng)性抵抗機(jī)制，常見于惡性血液病和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。BsAb也報導(dǎo)有TAA下調(diào)，導(dǎo)致藥物活性下降。對于TCR－T細(xì)胞，逃避的主要機(jī)制是MHC的丟失或下調(diào)，這是由于不同的過程造成的，如雜合度的喪失、單個HLA基因的轉(zhuǎn)錄抑制、參與抗原處理或呈遞的關(guān)鍵基因的表觀遺傳沉默以及干擾素反應(yīng)途徑。

提高TCE在實體瘤治療中的有效性

許多不同的策略正在研究以進(jìn)一步提高TCE的療效。檢查點抑制結(jié)合TCEs是一種有趣的方法；CAR－T細(xì)胞和PD－L1抑制劑已經(jīng)在不同的臨床試驗中成功地進(jìn)行了研究。臨床前研究表明，PD－1抑制也可以通過CRISPR－Cas9技術(shù)的基因缺失來實現(xiàn)，包括PD－1的開關(guān)受體結(jié)構(gòu)，添加能夠?qū)⒇?fù)信號轉(zhuǎn)換為刺激信號的CD28結(jié)構(gòu)域，或者表達(dá)缺乏信號結(jié)構(gòu)域的PD－1抑制性受體。此外，與其他免疫檢查點的組合可能是一個有趣的途徑，包括CTLA－4、LAG－3、TIM－3和IDO，或協(xié)同刺激受體4－1BB、OX40、CD40和CD27。

新一代TRUCK CAR－T細(xì)胞采用細(xì)胞因子調(diào)節(jié)方法，如IL－12、IL－15、IL－18，可克服免疫抑制的腫瘤微環(huán)境。基于患者自身腫瘤新抗原的個性化TCR－T細(xì)胞治療是另一種高度復(fù)雜的研究方法。該過程包括新抗原鑒定、TCR克隆、病毒載體或其他技術(shù)的組裝和驗證。然而，這個過程應(yīng)該用不同的新抗原重復(fù)，因為單個突變并不是在所有腫瘤細(xì)胞中都表達(dá)，這是一個顯著的障礙。

聯(lián)合GE－ACTs和BsAb的新技術(shù)也在得到開發(fā)，即所謂的雙特異性抗體武裝的活化T細(xì)胞（BAT）。這些BAT具有將旁觀者T細(xì)胞重新定向到腫瘤細(xì)胞的能力，并且在體內(nèi)具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性，因此無需反復(fù)輸注BsAb。除CD3外的新型BsAb T細(xì)胞接合器也在研究中，比如γ－δ T細(xì)胞接合器。

提高TCE在實體瘤治療中的安全性

同時，其他策略也在努力提高TCE的安全性。自殺基因具有控制工程細(xì)胞凋亡的能力。單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）正在CAR－T細(xì)胞中進(jìn)行研究，然而，目前尚不清楚HSV－TK是否具有潛在的免疫原性，從而影響T細(xì)胞的存活，以及誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的時間是否足以控制患者的毒性。另一種免疫原性較低的方法是誘導(dǎo)性安全開關(guān)caspase9（iCasp9），它包含一個與FK506結(jié)合蛋白融合的修飾人caspase9。iCasp9的誘導(dǎo)依賴于AP1903的使用，AP1903是一種二聚化的化學(xué)誘導(dǎo)劑，它激活caspase分子導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

抑制性CARs（iCAR）可用于T細(xì)胞，以控制對健康組織的毒性。iCAR由一個對僅在正常細(xì)胞中表達(dá)的抗原特異性單鏈抗體組成，具有強(qiáng)大的急性抑制信號，盡管激活受體同時參與，但仍能限制T細(xì)胞的激活。

CAR－T和BsAb的結(jié)合也可以提高耐受性。例如，CAR被設(shè)計成與異硫氰酸熒光素（FITC）結(jié)合，而FITC不是靶標(biāo)，而是一種通用結(jié)合，BsAb則將FITC與靶點結(jié)合。因此，在沒有BsAb的情況下，CAR－T不會被激活，并且可以通過BsAb的劑量進(jìn)行調(diào)節(jié)。

最后，組合靶抗原識別是另一種提高耐受性的方法。在這種情況下，T細(xì)胞的激活依賴于兩個不同CAR的共同激活，一個與CD3轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，另一個與共刺激受體CD28或4－1BB有關(guān)。對于BsAb，除了腫瘤相關(guān)抗原外，目前正在探索針對非CD3 T細(xì)胞受體的新一代BsAb，如針對腫瘤PD－L1（NCT03917381）或FAP（EudraCT 2017－000292－83）到4－1BB、LAG－3（NCT0414000）或TIM－3（NCT0375217）的BsAb。

小結(jié)

目前，越來越多更好的TCE正在研究中，可能在未來實體腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。GE－ACTs和BsAb在其作用機(jī)制和耐受性方面有相似之處，但仍有改進(jìn)的余地，而且在難治性癌癥中已有一些令人鼓舞的真正的腫瘤反應(yīng)。但由于實體瘤的復(fù)雜性，許多耐藥機(jī)制如腫瘤微環(huán)境的抑制、腫瘤抗原的異質(zhì)性或逃避機(jī)制等仍有待解決。個性化新抗原導(dǎo)向的TCR－T、雙特異性或三特異性CAR－T細(xì)胞、BAT或與檢查點抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)成為一種有前途的新療法。從安全性的角度來看，自殺基因的引入、抑制性CARs、CARs與BsAb的結(jié)合、靶抗原的組合識別等都是可能改變實體瘤患者未來發(fā)展前景的一些新的研究方法。

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