近期，National Cancer Institute （NCI）和Kite等聯(lián)合發(fā)文－《Safety and feasibility of anti－CD19 CAR T cells with fullyhuman binding domains in patients with B－cell lymphoma》，介紹了新的CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的全人源化的抗CD19 CAR－T細(xì)胞的I期臨床試驗(yàn)（NCT02659943）。

圖1 Hu19－CD828z和FMC63－28z的CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)圖

具體CAR設(shè)計(jì)如圖1所示，其中Hu19－CD828z是新設(shè)計(jì)，F(xiàn)MC63－28z是已上市的Yascarta的結(jié)構(gòu)。這個(gè)試驗(yàn)結(jié)果顯示，Hu19－CD828Z T細(xì)胞具有與表達(dá)FMC63－28Z的T細(xì)胞相似的臨床抗淋巴瘤活性，55％患者獲得了完全緩解。

然而，接受Hu19－CD828Z T細(xì)胞的患者中只有5％發(fā)生嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)毒性，而接受 FMC63－28Z T細(xì)胞的患者中有50％經(jīng)歷了這種程度的毒性（P＝0．0017）。在接受Hu19－CD828Z T細(xì)胞的患者的血液中檢測到的細(xì)胞因子水平低于接受FMC63－28Z T細(xì)胞的患者的血液，這可以解釋與Hu19－CD828Z相關(guān)的較低水平的神經(jīng)毒性。表達(dá)CAR的T細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子水平特別取決于CAR設(shè)計(jì)中包含的鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域。

由此案例出發(fā)，本文計(jì)劃探討工程化CAR的細(xì)胞外、間隔區(qū)、跨膜和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的最新進(jìn)展，以及它們?nèi)绾斡绊慍AR－T功能。這種系統(tǒng)分析可以幫助揭示設(shè)計(jì)原則，這些原則可以廣泛應(yīng)用于未來的設(shè)計(jì)者免疫療法。

1

CAR的基本結(jié)構(gòu)介紹

圖2 嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)概述

CAR結(jié)構(gòu)包括三個(gè)主要部分胞外結(jié)合域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域由抗原結(jié)合域（通常是單鏈可變片段scfv）和鉸鏈區(qū)構(gòu)成。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括共刺激結(jié)構(gòu)域和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。
以下分為胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域三部分來介紹。

2

胞外結(jié)構(gòu)域

2．1

抗原結(jié)合域介紹

CAR胞外域設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)方法基于單克隆抗體，其可變區(qū)連接成單鏈可變片段或scFv（圖3）。另一種在臨床上用的方法是利用天然存在的受體－配體對。還有一種具有巨大潛力的相關(guān)方法是使用駱駝單域抗體片段，其特點(diǎn)是缺乏輕鏈，這種“納米抗體”顯示出有效的體內(nèi)腫瘤靶向性，并且沒有免疫原性。

圖3 嵌合抗原受體 （CAR）－T 細(xì)胞的胞外結(jié)構(gòu)域

scFv的四個(gè)重要特征是免疫原性、親和力、特異性及其結(jié)合表位。

從鼠雜交瘤中獲得的單克隆抗體 （mAb） 被發(fā)現(xiàn)在人類中具有免疫原性，導(dǎo)致低效力和立即從循環(huán)中消除，還表現(xiàn)出全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致嚴(yán)重的生理并發(fā)癥。因此，scFv的人源化有助于提高CAR的安全性和治療潛力。

親和力是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，它解釋了多種受體－配體相互作用，并受CAR表達(dá)水平、靶細(xì)胞上的配體密度和單個(gè)配體結(jié)合域的親和力影響。親和力已被調(diào)節(jié)以提CAR的特異性并減少“在靶點(diǎn)、腫瘤外”副作用，當(dāng)靶標(biāo)抗原在健康組織上普遍表達(dá)時(shí)，這一點(diǎn)尤其重要。親和力調(diào)節(jié)可以影響CAR信號(hào)傳導(dǎo)和其他效應(yīng)器功能，如細(xì)胞因子分泌、增殖和持久性。

腫瘤相關(guān)抗原（TAA）是免疫治療的主要靶點(diǎn)，在腫瘤組織中高度表達(dá)，在健康組織中也以較低水平表達(dá)。這會(huì)導(dǎo)致不必要的識(shí)別，有時(shí)還會(huì)導(dǎo)致危及生命的毒性。因此，在設(shè)計(jì) CAR 以區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常組織時(shí)，scFv 選擇至關(guān)重要。為避免這些并發(fā)癥，應(yīng)仔細(xì)了解 CAR scFv 與靶抗原之間的相互作用，并應(yīng)在最終確定 scFv 之前進(jìn)行交叉反應(yīng)性研究。

目標(biāo)表位的結(jié)構(gòu)、空間可用性和功能方面也需要包括在CAR的設(shè)計(jì)考慮中。新的CAR設(shè)計(jì)，例如利用串聯(lián)連接的scFv序列靶向兩個(gè)抗原的雙特異性CAR，可能需要額外的設(shè)計(jì)工作來確定合適的CAR結(jié)構(gòu)，從而允許訪問兩個(gè)目標(biāo)。

文獻(xiàn)報(bào)道低親和力的CD19 CAR與傳統(tǒng)的基于FMC63的CAR相比，低親和力抗CD19 CAR （CAT－CAR）顯示出增加的抗原特異性增殖和增加的體內(nèi)持久性，即使發(fā)現(xiàn)兩者都靶向 CD19 抗原上的相似表位。兩種CAR的IL－2和IFNγ分泌水平相當(dāng)，而TNFα 在低親和力 CAT－CAR（體外和體內(nèi)的情況下略有增加）。

圖4 FMC63 CAR 和CAT－CAR的親和力差異

因此，scFv 的這四個(gè)方面（免疫原性、特異性、親和力、目標(biāo)定位）對于確定 CAR T 細(xì)胞的安全性和功能功效至關(guān)重要。

2．2

鉸鏈區(qū)介紹

鉸鏈／間隔區(qū)區(qū)域由CAR的非抗原結(jié)合細(xì)胞外區(qū)域組成。將scFv連接到跨膜域的間隔域?yàn)閟cFv提供了靈活性并有助于提高功效。已經(jīng)觀察到，鉸鏈／間隔區(qū)通過提供柔韌性，延長長度，允許二聚化或改善穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)CAR功能。已經(jīng)提出這些性質(zhì)影響效應(yīng)細(xì)胞－靶細(xì)胞相互作用，從而影響活化信號(hào)強(qiáng)度。

常見的鉸鏈／間隔區(qū)已利用免疫球蛋白Fc，CD8a和CD28間隔區(qū)。當(dāng)使用來自IgG1或IgG4的鉸鏈－CH2－CH3間隔區(qū)構(gòu)建CAR時(shí)，它們表現(xiàn)出與Fc γ受體的結(jié)合。這通過加速衰老、激活誘導(dǎo)細(xì)胞死亡等對持久性和活性產(chǎn)生負(fù)面影響，但CH2結(jié)構(gòu)域的突變或缺失減輕了這些影響。

開頭介紹的文章中作者同一個(gè)CAR將CD28鉸鏈區(qū)換成CD8鉸鏈區(qū)，就影響了神經(jīng)毒性。

Almasbak等考察了沒有鉸鏈域的CAR－T細(xì)胞能否增強(qiáng)腫瘤殺傷是一個(gè)問題。因此，設(shè)計(jì)了兩種有或沒有鉸鏈域的CAR來研究這個(gè)問題。最后，結(jié)論是鉸鏈可以增強(qiáng)某些特定CAR－T細(xì)胞的擴(kuò)增和抗腫瘤功效。因此，在設(shè)計(jì)CAR時(shí)應(yīng)考慮抗原靶點(diǎn)位置和鉸鏈長度，這對CAR－T細(xì)胞的活性至關(guān)重要。

圖5 體內(nèi)缺乏抗白血病活性與 IgG1－Fc 間隔區(qū)有關(guān)

為了保持最佳突觸距離，膜遠(yuǎn)端表位通常需要較短的間隔區(qū)，而膜近端表位需要較長的間隔區(qū)。改變間隔長度會(huì)對CAR－T細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性和信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

3

跨膜結(jié)構(gòu)域介紹

CAR結(jié)構(gòu)中的跨膜結(jié)構(gòu)域作為將配體識(shí)別信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的支點(diǎn)。多年來，CAR跨膜結(jié)構(gòu)域的相關(guān)性在很大程度上被忽略了，因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)成分被認(rèn)為仍然是受體的惰性部分�？缒�區(qū)具有為CAR受體提供穩(wěn)定性的能力，有助于與可能影響CAR T細(xì)胞功能的其他細(xì)胞表面蛋白締合。鉸鏈／間隔物設(shè)計(jì)的重要性差異很大，可能需要根據(jù)目標(biāo)表位的相對位置逐案確定靈活性和距離要求。

為了闡明鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域在CAR 和 CAR－T 細(xì)胞功能中的作用，生成了不同的嵌合體并分析了它們在CAR－T細(xì)胞上的表達(dá)水平和抗原特異性活性。首先，創(chuàng)建了一個(gè)具有鉸鏈、跨膜和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域源自 CD3ζ，然后生成了六個(gè) CAR 變體，其鉸鏈或鉸鏈／跨膜域源自CD4、CD8α和CD28。T細(xì)胞上的CAR表達(dá)水平和穩(wěn)定性受跨膜而非鉸鏈結(jié)構(gòu)域的影響很大。大多數(shù)CAR－T細(xì)胞的抗原特異性功能取決于它們的CAR表達(dá)水平。

然而，盡管表達(dá)水平相同，但具有CD8α 或CD28衍生鉸鏈域的CAR在CAR－T細(xì)胞功能方面表現(xiàn)出顯著差異。這些結(jié)果表明［7］，進(jìn)入T細(xì)胞的CAR信號(hào)強(qiáng)度不僅受CAR表達(dá)水平的影響，還受鉸鏈結(jié)構(gòu)域的影響，鉸鏈域調(diào)節(jié)CAR信號(hào)閾值，跨膜域通過控制CAR表達(dá)水平來調(diào)節(jié)CAR 信號(hào)量。

圖6． 帶有鉸鏈域 （HD）或鉸鏈／跨膜域 （HD／TMD） 修飾的血管內(nèi)皮生長因子受體 2 （VEGFR2） 特異性嵌合抗原受體 （CAR） 的圖示。

跨膜介導(dǎo)的相互作用也可用于產(chǎn)生新的CAR設(shè)計(jì)，例如可以傳遞跨細(xì)胞質(zhì)域信號(hào)的拆分CAR系統(tǒng)。

圖7． 跨膜域相互作用可以提供新穎的CAR設(shè)計(jì)［2］

4

胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括共刺激結(jié)構(gòu)域和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。

4．1

CAR的不同代次

根據(jù)胞內(nèi)共刺激域的差異，將CAR分為四個(gè)不同的代次。

圖8 設(shè)計(jì)嵌合抗原受體 （CAR）－T 細(xì)胞：CAR 蛋白利用抗體的抗原識(shí)別能力

最基本的CAR設(shè)計(jì)，稱為第一代CAR，包含一個(gè)抗原結(jié)合域，該域直接融合到TCR不變鏈CD3ζ的細(xì)胞內(nèi)部分。第一代CAR通過磷酸化CD3ζ中基于免疫受體酪氨酸的激活基序 （ITAM） 域來啟動(dòng)激活級聯(lián)反應(yīng)。該信號(hào)不足以激活T細(xì)胞，需要外源性給予細(xì)胞因子。因此，最初的臨床試驗(yàn)產(chǎn)生了令人失望的結(jié)果。

第二代CAR－T細(xì)胞將來自其他受體（如CD28、4－1BB （CD137））的共刺激結(jié)構(gòu)域整合到CAR的細(xì)胞內(nèi)片段中，以提高激活、增殖和存活率。這一概念在一項(xiàng)優(yōu)雅的臨床研究中得到了證明，將CD28作為共刺激摻入CD19 CAR－T細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞擴(kuò)增和存活率增加 ［15］。

第三代CAR－T細(xì)胞結(jié)合了幾個(gè)信號(hào)域，期望能增強(qiáng) T 細(xì)胞的活化、增殖和存活。然而，在實(shí)踐中，這種方法提供的臨床益處仍在討論中。

最近提出了第四代CAR－T細(xì)胞，因?yàn)樗�引入了一個(gè)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，能夠觸發(fā)由細(xì)胞因子誘導(dǎo)的信號(hào)（信號(hào)3）。
考慮到最終控制抗腫瘤功效的變量的多樣性，每個(gè)特定共刺激信號(hào)的貢獻(xiàn)對于每種腫瘤類型、胞外域和／或靶抗原是不同的。需要在CAR背景下對共刺激的分子免疫生物學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)的重新評估，以解決這些系統(tǒng)的復(fù)雜性，并為合理設(shè)計(jì)下一代CAR－T細(xì)胞制定指導(dǎo)方針。

4．2

共刺激結(jié)構(gòu)域介紹

最常見的共刺激域是CD28和4－1BB。CD28共刺激提供更強(qiáng)烈的急性反應(yīng)和有限的長期持久性的一般趨勢，而4－1BB共刺激則相反。

已經(jīng)研究了許多共刺激分子，包括CD28、4－1BB （CD137）、CD27、OX40 （CD134） 和 ICOS，它們已被納入CAR的設(shè)計(jì)在臨床中以進(jìn)一步驗(yàn)證治療效果。

多種共刺激結(jié)構(gòu)域及其組合已在體外和體內(nèi)進(jìn)行了測試，但對于CAR－T細(xì)胞的理想設(shè)計(jì)尚未達(dá)成共識(shí)。共刺激域的選擇可能取決于臨床適應(yīng)癥以及其他 CAR模塊。

Guedan及其同事探索了4－1BB、ICOS和CD3ζ的多種細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組合，發(fā)現(xiàn)表達(dá)具有ICOS－4－1BB－CD3ζ細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和ICOS跨膜結(jié)構(gòu)域的CAR 的T細(xì)胞導(dǎo)致體內(nèi)擴(kuò)增和持久性增強(qiáng)35天內(nèi)腫瘤消退100％。值得注意的是，具有ICOS–4–1BB–CD3ζ 但使用CD8跨膜結(jié)構(gòu)域的CAR僅顯示適度的腫瘤消退。鑒于這種CD8修飾的CAR也表達(dá)較低水平的IL－13和IL－6，作者認(rèn)為細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的近膜部分在確定CAR－T細(xì)胞的細(xì)胞因子譜中具有重要作用。

圖9 包含與間皮素結(jié)合并在跨膜和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域不同的 SS1 單鏈片段的嵌合受體的示意圖

圖10  ICOSBBz增強(qiáng)的體內(nèi)功能僅在ICOS靠近細(xì)胞膜時(shí)觀察到

4．3

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

ITAM是造血細(xì)胞受體胞質(zhì)域中的序列基序。T細(xì)胞和傳統(tǒng)CAR－T細(xì)胞在參與信號(hào)傳導(dǎo)的ITAM數(shù)量方面存在主要差異。將ITAM的數(shù)量從三個(gè)減少到兩個(gè)，可以選擇性識(shí)別表達(dá)高目標(biāo)密度的細(xì)胞。
馬茲納等人還表明，在基于4－1BB 的第二代CAR中，CD3ζ ITAMs 從3個(gè)增加到 6 個(gè)增加了T細(xì)胞增殖、IL－2 產(chǎn)生以及體內(nèi)抗腫瘤反應(yīng)。在另一項(xiàng)研究中，CD3ζ 的每個(gè)ITAM 都發(fā)生了突變，發(fā)現(xiàn)功能性ITAM的數(shù)量及其位置都會(huì)影響CAR－T細(xì)胞增殖、體內(nèi)腫瘤根除以及分化表型。在同一項(xiàng)研究中，作者表明單個(gè)膜近端功能性ITAM與CD28細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合能夠維持增殖、持久性和細(xì)胞毒性。

圖11 野生型和突變型1928ζ CAR 的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。

在CAR－T細(xì)胞中，受ITAM影響的信號(hào)機(jī)制尚不清楚。特別是，反式ITAM的可用性增強(qiáng)了 T 細(xì)胞中不同的信號(hào)機(jī)制。ITAM的這些方面對CAR設(shè)計(jì)有影響，對信號(hào)這些方面的更好理解可以極大地為 CAR－T 設(shè)計(jì)提供信息。

結(jié)論和挑戰(zhàn)

CAR 結(jié)構(gòu)的每個(gè)模塊都獨(dú)立和協(xié)同地影響 CAR 功能。
降低 scFv 的親和力已被證明可以提高對腫瘤的選擇性識(shí)別，從而降低對靶點(diǎn)和腫瘤外的毒性。然而，降低親和力也會(huì)導(dǎo)致活化和抗腫瘤細(xì)胞毒性降低。選擇正確的細(xì)胞質(zhì)域可以增強(qiáng)這些信號(hào)。間隔區(qū)的長度和性質(zhì)會(huì)影響免疫突觸距離，并且對于確定細(xì)胞溶解至關(guān)重要。

與scFv 結(jié)合使用時(shí)，間隔區(qū)對于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)表位的可及性至關(guān)重要�？缒そY(jié)構(gòu)域是關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)成分，有可能被用于具有共刺激結(jié)構(gòu)域和 CD3ζ 結(jié)構(gòu)域反式耦合的新型 CAR 系統(tǒng)。在這篇綜述中，我們專注于討論 CAR 分子本身的設(shè)計(jì)，但必須承認(rèn)CAR蛋白以外的參數(shù)會(huì)顯著影響CAR－T細(xì)胞功能也很重要。例如，轉(zhuǎn)導(dǎo)載體系統(tǒng)的選擇和CAR的插入位點(diǎn)對療效有深遠(yuǎn)的影響。
許多研究采用合理的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)和／或文庫篩選來優(yōu)化CAR序列。CAR組件可以根據(jù)其體外和體內(nèi)功能以組合或順序方式進(jìn)行修飾。在一項(xiàng)研究中，使用兩個(gè)不同的scFv序列靶向CD19和CD20的雙特異性CAR依次確定了間隔區(qū)和 scFv接頭要求，以實(shí)現(xiàn)對兩種抗原的最佳靶向。

CAR－T 開發(fā)的第二個(gè)主要障礙是確定與體內(nèi)功效相關(guān)的體外定量參數(shù)。已經(jīng)表明，諸如體外活化和細(xì)胞因子釋放等參數(shù)并不總是與所需的體內(nèi)結(jié)果相關(guān)。最終，需要開發(fā)和驗(yàn)證用于CAR－T設(shè)計(jì)的體外功能分析，并與動(dòng)物模型和臨床數(shù)據(jù)的體內(nèi)結(jié)果相關(guān)聯(lián)。

沿著這條線，多功能性，即 T 細(xì)胞產(chǎn)生不止一種類型的細(xì)胞因子的能力，作為與體內(nèi)功效相關(guān)的體外測量方法已經(jīng)受到關(guān)注。使用一種新型的基于單細(xì)胞的測定法測試了輸注前抗CD19 CAR－T 產(chǎn)品的32種不同細(xì)胞因子和趨化因子，據(jù)報(bào)道，增加的多功能性與改善的患者反應(yīng)相關(guān)�？梢远�量詢問預(yù)測體內(nèi) CAR－T 細(xì)胞功能的參數(shù)的功能分析平臺(tái)將極大地促進(jìn)相關(guān) CAR 設(shè)計(jì)原理的闡明，能夠更好地理解CAR－T細(xì)胞生物學(xué)，并促進(jìn) CAR 格式的發(fā)現(xiàn)新功能。
最終，這些努力可以簡化免疫療法的發(fā)現(xiàn)過程，從而以更低的成本和更短的開發(fā)時(shí)間獲得有效的CAR－T候選藥物。

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