在過去的十年里，免疫療法的出現(xiàn)確實徹底改變了癌癥治療的模式。許多靶向程序性細胞死亡蛋白－1（PD－1）或其配體（PD－L1）的治療藥物已被監(jiān)管機構(gòu)批準作為單一治療藥物，或與化療和其他靶向藥物聯(lián)合使用。在臨床研究中，PD－L1免疫組織化學(xué)（IHC）和腫瘤突變負荷（TMB）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的主要預(yù)測性生物標記物，然而，PD－L1 IHC仍然是臨床實踐中用于告知免疫檢查點抑制劑（ICI）治療的主要輔助診斷試驗。

PD－L1在腫瘤細胞和腫瘤浸潤性免疫細胞表面表達，在多種腫瘤類型的研究已經(jīng)確定了PD－L1水平與單藥抗PD－1／PD－L1治療的臨床益處之間的關(guān)聯(lián)。雖然PD－L1高表達的患者通常能獲得最大的臨床益處，但腫瘤低或無PD－L1表達的患者也依然能受益，這促使我們需要進一步探索不斷進化的癌癥基因組變化與浸潤性免疫細胞亞型之間的因果關(guān)系。

考慮到PD－L1作為單一生物標記物的局限性，我們需要了解復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境（TME），以開發(fā)更好的生物標記物和診斷方法，更準確地預(yù)測臨床效益，至關(guān)重要的是，更有針對性地對腫瘤產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。

預(yù)測性生物標志物

PD－L1 IHC

與突變的二元性不同，PD－L1是一種線性生物標記物，因此可以在多個表達閾值下進行評估。由于腫瘤細胞和免疫細胞上PD－L1表達的復(fù)雜生物學(xué)特性，已批準的PD－L1 IHC分析不僅采用不同的表達閾值，而且采用不同的評分方法。PD－L1評分算法具有分析特異性、適應(yīng)癥依賴性，并且根據(jù)治療路線而變化。有些檢測僅對腫瘤細胞表達進行評分（忽略免疫細胞），而有些檢測僅對免疫細胞的PD－L1進行評估（忽略腫瘤細胞），其它檢測則對腫瘤和免疫細胞的PD－L1同時進行測量。下表顯示了非小細胞肺癌（NSCLC）中使用的主要PD－L1 IHC分析的截止值。需要注意的是，這些經(jīng)驗證的截止值的批準和用途是特定于國家的。

PD－L1的表達是動態(tài)的，在腫瘤類型、腫瘤部位，甚至在同一腫瘤標本中表現(xiàn)出顯著差異。腫瘤細胞中PD－L1的表達受基因組、表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄機制的調(diào)控。腫瘤細胞上的PD－L1與NSCLC中CD8＋T細胞浸潤程度之間的強相關(guān)性很可能是由于對炎癥信號（如IFN－γ）反應(yīng)中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，這些炎癥信號是由活躍的抗腫瘤免疫反應(yīng)產(chǎn)生的。

PD－L1的非均勻表達（通常局限于免疫浸潤區(qū)域）表明，由于TME內(nèi)相關(guān)細胞因子的高局部濃度，PD－L1被適應(yīng)性誘導(dǎo)，并進一步突出了腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性。PD－L1的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和可塑性可能會影響患者的管理決策，此外，由于采樣可能會產(chǎn)生假陰性得PD－L1 IHC結(jié)果�；顧z的位置和已進行過的治療是PD－L1表達的重要參數(shù)。由于臨床原因，在治療開始時獲得新的活檢可能不可行，但由于免疫反應(yīng)的可塑性，尤其是PD－L1，存檔腫瘤標本不一定反映復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性病變中的TME。

多種免疫細胞類型，主要是巨噬細胞、樹突狀細胞（DC），以及T細胞、NK細胞和B細胞，可表達PD－L1。目前尚不清楚哪些特定免疫群體或免疫細胞的空間特征與臨床最相關(guān)。需要使用多重IHC技術(shù)進一步描述腫瘤細胞與特定免疫細胞亞群的空間相互作用，以確定是否需要繼續(xù)將免疫細胞分類為一個更廣泛的類別，這需要更細致、更復(fù)雜的分析。

其它生物標志物

臨床試驗表明，具有大量效應(yīng)T細胞的腫瘤對ICI治療更為敏感。有研究使用以IFN－γ為中心的基因表達特征來顯示使用抗PD－1抗體pembrolizumab治療的黑色素瘤患者的總體應(yīng)答率（ORR）和無進展生存率（PFS）的相關(guān)性。與這些發(fā)現(xiàn)一致，在NSCLC中進行的IMpower150試驗報告了一種T效應(yīng)細胞（Teff）基因表達特征，由PD－L1、CXCL9和IFN－γ組成，當(dāng)比較atezolizumab聯(lián)合化療比較單獨化療時，該特征對PFS有益。

此外，具有高突變負荷的腫瘤患者從CI治療中獲得了更大的臨床益處。TMB和PD－L1 IHC的一致性研究似乎表明，這些生物標記物是正交的，并獨立預(yù)測CI治療的益處。因此，pembrolizumab最近獲得了監(jiān)管部門的批準，用于治療先前治療后有進展且無替代治療方案的不可切除或轉(zhuǎn)移性高TMB實體瘤。

隨著對更具預(yù)測性的生物標志物的研究不斷深入，有必要擺脫單一分析方法，整合負責(zé)進行免疫反應(yīng)的各種生物過程。初步的探索性分析表明，聯(lián)合生物標志物可以轉(zhuǎn)化為臨床益處。在Checkmate－026和Checkmate－227研究中，腫瘤表達高水平PD－L1并具有高組織TMB狀態(tài)的患者從抗PD－1抗體nivolumab治療中獲得最大益處。OAK研究也報告了類似的結(jié)果。

免疫效應(yīng)細胞的表型多樣性

許多研究已經(jīng)描述了腫瘤浸潤淋巴細胞及其空間分布與治療效益之間的關(guān)系。識別各種免疫效應(yīng)細胞的空間分布需要通過功能分析來補充，如激活標記物和抗原反應(yīng)性，通過分析腫瘤樣本中CD8＋T細胞TCR序列的內(nèi)在抗腫瘤反應(yīng)性，表明識別自體腫瘤的能力僅限于少數(shù)腫瘤浸潤CD8＋T細胞。更復(fù)雜的是，腫瘤不同區(qū)域（中心與邊緣浸潤）的CD4＋和CD8＋T細胞群中可能存在顯著的TCR異質(zhì)性，異質(zhì)性的程度具有預(yù)后意義。

通常，三種不同的CD8＋T細胞群體可根據(jù)共同的轉(zhuǎn)錄譜識別：

表達CC－趨化因子受體7（CCR7）和轉(zhuǎn)錄因子7（TCF7）的原始或記憶細胞；

穿孔素1（PRF1）、顆粒酶A（GZMA）和GZMB陽性的細胞毒性細胞；以及

“功能失調(diào)”的多樣性細胞群體，其特征是與耗竭狀態(tài)相關(guān)的標記物，如PD－1（PDCD1）、LAG3和TIM3（HAVCR2）。

這三個群體的相對比例似乎高度可變，不僅在不同的腫瘤類型中如此，在相同組織學(xué)的腫瘤中也是如此。轉(zhuǎn)錄譜和TCR測序信息已被用于確定腫瘤內(nèi)CD8＋細胞表型是否發(fā)生改變。初步模型表明，TME誘導(dǎo)的表型異質(zhì)性功能失調(diào)細胞群從幼稚的CD8＋細胞進化而來，而后者以不依賴TME的方式產(chǎn)生細胞毒性細胞。“功能失調(diào)”細胞庫中的細胞在多大程度上可以轉(zhuǎn)化為“細胞毒性”狀態(tài)目前尚不清楚，然而，了解這一點對于設(shè)計促進和觸發(fā)這種轉(zhuǎn)變的療法非常重要。

此外，在幾項研究中已經(jīng)鑒定出對腫瘤表達的新抗原具有特異性的腫瘤內(nèi)CD8＋T細胞，但其只是表型異質(zhì)性總?cè)后w的一小部分。有趣的是，CD39似乎能夠區(qū)分腫瘤特異性（高CD39）和旁觀者（低CD39）CD8＋T細胞。其他表型和功能分析顯示，CD39＋亞群共表達CD103以及PD－1、TIM3和CTLA－4，這些標記通常與耗竭狀態(tài)相關(guān)。CD39和CD103的共同表達依賴于通過TCR的長時間刺激和TGF－β的暴露。有趣的是，高水平的CD39＋CD103＋雙陽性細胞似乎轉(zhuǎn)化為鱗狀細胞頭頸癌患者的生存益處。

免疫效應(yīng)細胞的空間分布

最新的研究分析了CD8＋T細胞和MHCII類表達細胞（最可能的抗原呈遞細胞）之間的空間關(guān)系。在腎細胞癌患者中，TCF1＋／CD8＋T細胞優(yōu)先共定位于MHC II類表達細胞的區(qū)域，而TCF1?／CD8＋細胞在整個腫瘤中呈彌散分布。TCF1＋／CD8＋細胞的發(fā)生率也與DC的發(fā)生率相關(guān)，而TCF1?／CD8＋細胞沒有表現(xiàn)出這種相關(guān)性。有趣的是，含有TCF1＋／CD8＋T細胞和表達MHC II類APC高密度區(qū)域的腫瘤具有更好的臨床療效，APC密集區(qū)可能為干細胞樣CD8＋T細胞分化為能夠維持抗腫瘤免疫反應(yīng)的效應(yīng)細胞提供了腫瘤內(nèi)環(huán)境。

很明顯，成熟、活躍的樹突狀細胞向腫瘤床的腫瘤浸潤增加了免疫激活和活性免疫效應(yīng)細胞的募集。準確識別和量化DCs具有重要價值，然而，標記物如CD11c、CD11b、CD163和MHC－II不是DC特異性的，并且在其他細胞類型如巨噬細胞上表達。DC可以促進或抑制新生免疫反應(yīng)的觀察結(jié)果進一步增加了復(fù)雜性，因為目前還沒有有效的標記來區(qū)分兩種DC狀態(tài)。

在腫瘤進展過程中，TME轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N主動保護腫瘤細胞免受免疫攻擊的環(huán)境，被認為具有腫瘤保護功能的TME細胞包括T調(diào)節(jié)細胞（Treg）、腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）、腫瘤相關(guān)成纖維細胞（CAFs）和髓系抑制細胞（MDSCs）。

腫瘤保護作用通常通過分泌的細胞因子和趨化因子介導(dǎo)，這些細胞因子和趨化因子可防止免疫效應(yīng)T細胞侵入腫瘤床或使這些細胞功能失效，例如，TGF－β。TGB－β抑制劑和抗PD－L1抗體的聯(lián)合治療可導(dǎo)致Teff的腫瘤內(nèi)滲透，將表型從“排除”改變?yōu)椤把仔浴�，減少轉(zhuǎn)移并提高長期生存率。

MDSC是中性粒細胞和單核細胞樣髓樣細胞的異質(zhì)群體，越來越多地被認為是各種癌癥免疫抑制的關(guān)鍵介質(zhì)。在癌癥患者中，循環(huán)MDSC數(shù)量的增加與晚期臨床分期、轉(zhuǎn)移性疾病發(fā)病率的增加和免疫抑制相關(guān)。除了免疫抑制功能外，MDSC還可以通過與腫瘤細胞和周圍基質(zhì)的復(fù)雜串?dāng)_積極塑造腫瘤微環(huán)境，從而增加血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。

腫瘤細胞的內(nèi)在抗性

目前，我們對于腫瘤免疫治療的不同反應(yīng)和耐藥機制的了解仍然有許多空白。雖然我們希望找到一顆靈丹妙藥，但可能的事實是，有許多機制有助于產(chǎn)生抵抗。雖然腫瘤抑制因子（如p53）的突變增加了突變負荷，有助于放大新抗原的數(shù)量，并使腫瘤對免疫系統(tǒng)更敏感，但這些突變也可以驅(qū)動抗原呈遞途徑和關(guān)鍵細胞機制的突變，從而觸發(fā)轉(zhuǎn)錄和代謝變化，進而對腫瘤浸潤性免疫細胞產(chǎn)生間接影響。

腫瘤抗原呈遞機制的一個關(guān)鍵組成部分是MHC I類分子，它由HLA I類（HLA－I）亞單位和β2微球蛋白（β2M）組成。MHC－I的下調(diào)存在于多種腫瘤類型中，可能通過多種機制發(fā)生，包括基因突變、表觀遺傳沉默、轉(zhuǎn)錄變化和翻譯后修飾。

MHC－I的下調(diào)如何影響TME？研究發(fā)現(xiàn)，HLA－I陽性表達與免疫浸潤密度相關(guān)，與PD－L1狀態(tài)無關(guān)。所有HLA－I＋／PD－L1＋的腫瘤都有高度的CD8＋T細胞浸潤，而HLA－I缺失與腫瘤內(nèi)T淋巴細胞數(shù)量減少相關(guān)，其空間局限于腫瘤周圍的基質(zhì)。而HLA－I－／PD－L1－的腫瘤較大，CD8＋T細胞密度較低。這項研究表明，腫瘤免疫逃逸表型結(jié)合了兩種獨立的免疫逃逸機制：HLA－I的丟失和PD－L1的上調(diào)。

新輔助治療中獲得經(jīng)驗

最近對早期疾病免疫治療的探索為了解TME及其在治療反應(yīng)中的變化提供了新的機會。新輔助研究特別豐富，因為治療前經(jīng)常收集診斷性活檢，并可與新輔助治療后立即進行的手術(shù)切除進行比較。

ABACUS試驗是一項單臂2期研究，研究膀胱切除術(shù)前atezolizumab的新輔助治療。升高的PD－L1水平（SP142；IC≥5％），基線Teff基因表達和上皮內(nèi)CD8＋T細胞與臨床益處相關(guān)。有趣的是，與術(shù)前相比，在治療后腫瘤樣本中觀察到上皮內(nèi)CD8＋T細胞和PD－L1＋免疫細胞的數(shù)量增加，并且這種增加在應(yīng)答者中比在復(fù)發(fā)患者中更為明顯。在治療后樣本中發(fā)現(xiàn)，TGF－β、成纖維細胞活化蛋白和細胞周期基因升高與耐藥性相關(guān)。

PURE－01研究報告了類似的結(jié)果，膀胱上皮癌患者在根治性膀胱切除術(shù)前接受了三個周期的pembrolizumab。與PD－L1狀態(tài)較低的患者相比，PD－L1 IHC升高的患者（22C3；CPS≥10％）獲得了更高的病理完全緩解率。與治療前活檢相比，治療后切除的PD－L1 CPS水平升高，TMB水平降低。此外，與治療前樣本相比，治療后樣本中的免疫相關(guān)基因（包括與IFN－γ信號、抗原呈遞和T細胞功能相關(guān)的基因）也有所增加。

NABUCCO研究評估了III期尿路上皮癌切除術(shù)前使用ipilimumab和nivolumab的效果。與ABACUS和PURE－01研究相比，治療結(jié)果與腫瘤內(nèi)CD8＋T細胞浸潤或Teff信號的基線狀態(tài)無關(guān)。相反，研究觀察到，在獲得完全應(yīng)答的患者中，TMB升高與DDR基因改變頻率升高之間存在一種趨勢。無法獲得完全應(yīng)答的患者在基線樣本中富含TGF－β基因表達特征，表明可能存在耐藥機制。此外，還研究了TIL密度與反應(yīng)之間的相關(guān)性，有趣的是，基線TIL與療效之間沒有相關(guān)性，但在治療后獲得CR的患者中觀察到TIL富集。

這些觀察結(jié)果并非膀胱癌所獨有。NEOSTAR試驗評估了nivolumab或nivolumab加ipilimumab作為可手術(shù)NSCLC患者的新輔助治療。獲得影像學(xué)或主要病理學(xué)反應(yīng)的患者總體上比基線腫瘤樣本的PD－L1更高。與單獨使用nivolumab治療相比，nivolumab加ipilimumab治療后TIL、組織駐留記憶T細胞、TEFF和效應(yīng)記憶T細胞的頻率更高。

總體來說，基線PD－L1似乎可以預(yù)測ICI的反應(yīng)。TMB、TIL和DDR等作為生物標志物也似乎很有希望，但需要進一步評估和驗證。治療方案的差異以及患者群體的異質(zhì)性可能導(dǎo)致不同試驗結(jié)果的不一致。隨著新輔助免疫治療和化療－免疫治療聯(lián)合方案獲得監(jiān)管部門的批準，識別經(jīng)驗證的生物標記物以預(yù)測免疫反應(yīng)對于幫助作出治療決定至關(guān)重要。

小結(jié)

隨著從化療向靶向治療和免疫治療的過渡不斷發(fā)展，研究人員將采用更復(fù)雜的臨床試驗設(shè)計，如靶向治療和免疫治療的聯(lián)合，不同CI藥物的聯(lián)合，并且更加關(guān)注生物標記物的設(shè)計，這些生物標記物對預(yù)測單藥或多藥治療方案的反應(yīng)或耐藥性具有更高的敏感性。

未來，很可能需要多參數(shù)的方法來確定最有可能對ICI治療有反應(yīng)的患者，開發(fā)基于組織的強大復(fù)合技術(shù)非常重要。這有助于更準備地描述TME的特征，并分析腫瘤和效應(yīng)免疫細胞之間以及效應(yīng)細胞和APC之間的相互作用。相關(guān)標記物的表達譜可能提示效應(yīng)細胞的激活、抑制或耗竭狀態(tài)，并提示耐藥機制。

參考文獻：

1．Microenvironmental regulation of tumourimmunity and response to immunotherapy． J Pathol． 2021 Jul； 254（4）：374–383．