疫苗是預(yù)防傳染性疾病傳播的最有效的公共衛(wèi)生干預(yù)措施。成功的疫苗接種根除了許多威脅生命的疾病，如天花和脊髓灰質(zhì)炎，世界衛(wèi)生組織估計(jì)疫苗每年可防止200－300萬人死于破傷風(fēng)、百日咳、流感和麻疹。然而，盡管常規(guī)疫苗取得了明顯的成功，但它們并不能有效對(duì)付瘧原蟲、丙型肝炎和HIV等逃避免疫監(jiān)視的病原體。此外，它們需要定期修改以應(yīng)對(duì)快速變異的病原體，如流感病毒。

基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的，希望能產(chǎn)生安全、多功能、易于生產(chǎn)的疫苗。mRNA疫苗比傳統(tǒng)疫苗有許多優(yōu)點(diǎn)：與某些病毒疫苗不同，mRNA不會(huì)整合到基因組中，從而避免了對(duì)插入突變的擔(dān)憂；mRNA疫苗可以以無細(xì)胞的方式制造，從而實(shí)現(xiàn)快速、經(jīng)濟(jì)、高效的生產(chǎn)。此外，單個(gè)mRNA疫苗可以編碼多種抗原，增強(qiáng)針對(duì)適應(yīng)性病原體的免疫反應(yīng)，并能夠以單一配方針對(duì)多種微生物或病毒變體。

最初，由于擔(dān)心其穩(wěn)定性、低效性和過度免疫刺激，mRNA治療并沒有得到重視。然而在過去的十年中，mRNA治療領(lǐng)域日新月異，包括mRNA藥理學(xué)的深入研究，有效載體的開發(fā)和mRNA免疫原性的控制，使得mRNA疫苗的臨床應(yīng)用進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段。

mRNA的設(shè)計(jì)與合成

體外轉(zhuǎn)錄（IVT）mRNA模擬內(nèi)源性mRNA的結(jié)構(gòu)，有五個(gè)部分，從5?到3?包括：5?cap，5?非翻譯區(qū)（UTR），一個(gè)編碼抗原的開放閱讀框，3?UTR和一個(gè)PolyA尾。

與天然真核mRNAs一樣，5′端帽結(jié)構(gòu)包含一個(gè)7－甲基鳥苷核苷，5′端結(jié)構(gòu)會(huì)在空間上保護(hù)mRNA不被核酸外切酶降解，并與翻譯起始因子蛋白協(xié)同工作，招募核糖體以啟動(dòng)翻譯。PolyA尾的長度間接調(diào)節(jié)mRNA翻譯和半衰期。

編碼區(qū)兩側(cè)的5′和3′UTR調(diào)節(jié)mRNA翻譯、半衰期和亞細(xì)胞定位，來自高表達(dá)基因（如α－和β－珠蛋白基因）的天然UTR是合成mRNAs的首選。此外，UTR可根據(jù)細(xì)胞類型進(jìn)行優(yōu)化，如通過去除3′UTR中的miRNA結(jié)合位點(diǎn)和富含AU的區(qū)域，將mRNA降解降至最低。

mRNA疫苗的開放閱讀框是最關(guān)鍵的組成部分，盡管開放閱讀框不像非編碼區(qū)那樣具有可塑性，但可以通過優(yōu)化密碼子，從而在不改變蛋白質(zhì)序列的情況下增加翻譯。例如，CureVac AG公司發(fā)現(xiàn)人類mRNA密碼子很少在第三位有A或U，從而用G或C替換開放閱讀框第三位的A或U。并將此優(yōu)化策略用于其SARS－CoV－2疫苗CVnCoV，目前正處于III期試驗(yàn)階段。

為了最大化翻譯，mRNA序列通常包含修飾的核苷，例如假尿苷、N1－甲基假尿苷或其他核苷類似物。修飾核苷的使用，特別是修飾尿苷，阻止了模式識(shí)別受體的識(shí)別，保證了翻譯過程產(chǎn)生足夠水平的蛋白質(zhì)。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS－CoV－2疫苗都含有核苷修飾。另一種避免模式識(shí)別受體檢測的策略，由CureVac首創(chuàng)，使用序列工程化和密碼子優(yōu)化，通過提高疫苗mRNA的GC含量來消耗尿苷。

除了mRNA序列的改進(jìn)外，在簡化mRNA生產(chǎn)方面也取得了重大進(jìn)展。臨床上使用的合成mRNA通過使用噬菌體RNA聚合酶T7（也可以使用T3和SP6聚合酶）從DNA質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄。另外，使用CleanCap的共轉(zhuǎn)錄封蓋技術(shù)，簡化了純化步驟。

mRNA疫苗的載體

由于mRNA較大（104–106Da）且?guī)ж?fù)電，因此無法通過細(xì)胞膜的陰離子脂質(zhì)雙層。此外，在體內(nèi)，它會(huì)被先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞吞噬，并被核酸酶降解。因此，體內(nèi)應(yīng)用需要使用mRNA遞送載體，該載體轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞而不會(huì)引起毒性或不必要的免疫原性。目前，已經(jīng)為此開發(fā)了許多基于創(chuàng)新材料的解決方案。

脂質(zhì)納米顆粒（LNP）

脂質(zhì)納米顆粒是臨床上最先進(jìn)的mRNA載體。截至2021年6月，所有正在研制或批準(zhǔn)臨床使用的SARS－CoV－2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP為mRNA遞送提供了許多好處，包括制劑簡單、模塊化、生物相容性和較大的mRNA有效載荷容量。除RNA藥物外，LNP通常包括四種成分，可電離脂質(zhì)、膽固醇、輔助磷脂和聚乙二醇化脂質(zhì)，它們共同封裝和保護(hù)脆弱的mRNA。

可電離脂質(zhì)與mRNA在酸性緩沖液中形成納米顆粒，使脂質(zhì)帶正電荷并吸引RNA。此外，它們?cè)趦?nèi)涵體的酸性環(huán)境中帶正電荷，這促進(jìn)了它們與內(nèi)涵體膜的融合，將其釋放到細(xì)胞質(zhì)中。

DODAP和DODMA是第一種用于RNA輸送的可電離脂質(zhì)。通過設(shè)計(jì)提高DODMA的功效，產(chǎn)生了DLin－MC3－DMA。這是第一個(gè)FDA批準(zhǔn)的藥物制劑中使用的可電離脂質(zhì)：siRNA藥物patisiran（Onpattro）。除了有效且安全地遞送siRNA外，DLin－MC3－DMA還用于mRNA的遞送。

目前，學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的許多團(tuán)體使用組合反應(yīng)方案來合成潛在的傳遞材料，這種方法產(chǎn)生了許多有效的脂質(zhì)，包括C12－200、503O13、306Oi10、OF－02、TT3、5A2－SC8、SM－102（用于抗SARS－CoV－2的Moderna疫苗mRNA－1273）和ALC－0315（用于輝瑞疫苗BNT162b2）。

除了尋求提高療效外，人們?cè)絹碓疥P(guān)注提高藥物的特異性，特別是對(duì)疫苗和免疫療法的特異性。含有多環(huán)金剛烷尾的脂質(zhì)11－A－M58，和含有環(huán)咪唑頭的脂質(zhì)93－O17S59，已被設(shè)計(jì)用于體內(nèi)靶向T細(xì)胞。盡管機(jī)制尚不清楚，但這些脂質(zhì)的環(huán)狀基團(tuán)對(duì)于靶向T細(xì)胞至關(guān)重要。

盡管電離脂質(zhì)可以說是LNP最重要的成分，但其他三種脂質(zhì)成分（膽固醇、輔助脂質(zhì)和聚乙二醇化脂質(zhì)）也促進(jìn)了納米粒子的形成和功能。膽固醇是一種天然存在的脂質(zhì)，它通過填充脂質(zhì)之間的空隙來增強(qiáng)納米顆粒的穩(wěn)定性，并有助于在攝取到細(xì)胞的過程中與內(nèi)涵體膜融合。

輔助脂質(zhì)通過促進(jìn)有助于膜與內(nèi)涵體融合的脂質(zhì)相變來調(diào)節(jié)納米顆粒的流動(dòng)性并增強(qiáng)功效。最佳輔助脂質(zhì)的選擇取決于可電離脂質(zhì)材料和RNA載體。例如，對(duì)于類脂質(zhì)材料，飽和輔助脂質(zhì)（如DSPC）最適合傳遞短RNA（如siRNA），而不飽和脂質(zhì)（如DOPE）最適合傳遞mRNA 。DSPC已被用于FDA批準(zhǔn)的SARS－CoV－2疫苗mRNA－1273和BNT162b2中。

LNPs的聚乙二醇化脂質(zhì)成分由聚乙二醇（PEG）與錨定脂質(zhì)（如DMPE或DMG）結(jié)合而成。親水性PEG可以穩(wěn)定LNP，通過限制脂質(zhì)融合調(diào)節(jié)納米顆粒大小，并通過減少與巨噬細(xì)胞的非特異性相互作用增加納米顆粒半衰期。mRNA－1273和BNT162b2 SARS－CoV－2疫苗均含有聚乙二醇化脂質(zhì)。

聚合物和聚合物納米顆粒

盡管臨床進(jìn)展不如LNP，但聚合物具有與脂質(zhì)相似的優(yōu)勢，能夠有效傳遞mRNA。陽離子聚合物將核酸濃縮成具有不同形狀和大小的復(fù)合物，可通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。

聚乙烯亞胺是研究最廣泛的核酸傳遞聚合物。盡管其功效卓越，但由于其高電荷密度，其毒性限制了應(yīng)用。此外，已經(jīng)開發(fā)出幾種毒性較小的可生物降解聚合物。例如，聚（β－氨基酯）在mRNA傳遞方面表現(xiàn)出色，尤其是對(duì)肺。

最近開發(fā)出了一種新型的含脂聚合物，稱為電荷改變可釋放轉(zhuǎn)運(yùn)體（CARTs），它能有效地靶向T細(xì)胞，操縱T細(xì)胞是非常困難的，因此，CART 是一種極具吸引力的傳遞材料，在mRNA疫苗和基因治療領(lǐng)域具有巨大潛力。

其他遞送系統(tǒng)

除了脂質(zhì)和聚合物載體外，肽也可以將mRNA傳遞到細(xì)胞中，這要?dú)w功于其主鏈和側(cè)鏈中的陽離子或兩親胺基（例如精氨酸），這些陽離子或兩親胺基與mRNA靜電結(jié)合并形成納米復(fù)合物。例如，含有重復(fù)的精氨酸－丙氨酸－亮氨酸－丙氨酸（RALA）基序的膜融合細(xì)胞穿透肽。

富含精氨酸的魚精蛋白肽在中性pH下帶正電荷，也可以濃縮mRNA并促進(jìn)其傳遞。魚精蛋白與mRNA復(fù)合物激活識(shí)別單鏈mRNA的Toll樣受體（TLR7，TLR8）通路，因此，它還可以作為疫苗或免疫治療應(yīng)用的佐劑。CureVac AG正在評(píng)估一種含有魚精蛋白的遞送平臺(tái)RNActive，用于黑色素瘤、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌的臨床試驗(yàn)。

最后，基于角鯊烯陽離子納米乳液也可以傳遞mRNA，這些納米乳劑由油性角鯊烯核組成。一些角鯊烯制劑，如諾華的MF59，在FDA批準(zhǔn)的流感疫苗中用作佐劑。MF59使注射部位的細(xì)胞分泌趨化因子，從而招募抗原呈遞細(xì)胞，誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞，并增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞對(duì)抗原的攝取。角鯊烯基陽離子納米乳劑從內(nèi)涵體逃逸并將mRNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中的機(jī)制尚不清楚。

mRNA疫苗技術(shù)創(chuàng)新

mRNA疫苗技術(shù)最重要的創(chuàng)新在于：mRNA 序列設(shè)計(jì)；開發(fā)簡單、快速和大規(guī)模生產(chǎn) mRNA 的方法；開發(fā)高效、安全的 mRNA 疫苗遞送材料。

最近的一項(xiàng)研究使用了一種基于細(xì)胞培養(yǎng)的系統(tǒng)選擇過程來識(shí)別新的UTRs，它顯著增加了IVT mRNA的蛋白質(zhì)表達(dá)。與人類β－珠蛋白3’UTR的相比，這些序列可以誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生大約3倍的蛋白質(zhì)。

此外，最近報(bào)道了一種有趣的新疫苗形式，該方法利用編碼α病毒RNA依賴性RNA聚合酶的mRNA加上編碼抗原的第二個(gè)mRNA，使其在細(xì)胞質(zhì)中能夠復(fù)制。這種系統(tǒng)可以在非常低的劑量（50ng）就有效地誘導(dǎo)小鼠的保護(hù)性免疫反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)特別有吸引力，因?yàn)榈蛣┝康氖褂媒档土艘呙缟�產(chǎn)的成本。無遞送材料進(jìn)一步降低了成本，簡化了制造，并且提高了疫苗凍干和在環(huán)境溫度下儲(chǔ)存的可能性。

在生產(chǎn)方面，除了cleancap技術(shù)外，最近開發(fā)了一種通過將雙鏈RNA污染物吸附到纖維素（一種廉價(jià)且豐富的多糖）來純化mRNA的簡單方法。研究證明，這種高度可擴(kuò)展且廉價(jià)的方法與高效液相色譜法一樣有效地去除IVT mRNA樣本中的dsRNA污染物。

在遞送材料方面，與基于聚合物的CART平臺(tái)類似，mRNA－LNPs也實(shí)現(xiàn)了選擇性T細(xì)胞靶向。一種新的平臺(tái)，稱為ASSET（錨定二級(jí)靶向單鏈抗體），其中T細(xì)胞特異性單克隆抗體與LNP相連，以靶向T細(xì)胞。這種靈活的平臺(tái)在mRNA疫苗和其他應(yīng)用方面也有很大的潛力。

另外一種脂質(zhì)復(fù)合物在全身給藥后優(yōu)先靶向樹突狀細(xì)胞。用mRNA疫苗選擇性靶向DC以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)是一個(gè)潛在的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)，該平臺(tái)已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中證明了其前景。

小結(jié)

過去幾年在mRNA疫苗領(lǐng)域取得了極其重要的進(jìn)展，并為這種新型疫苗模式的可行性提供了證據(jù)。新的制造方法和遞送材料將有助于快速、廉價(jià)地大規(guī)模生產(chǎn)下一代mRNA疫苗。同樣還有許多地方需要深入研究，以及更全面地了解各種mRNA疫苗類型的作用機(jī)制，以進(jìn)一步地優(yōu)化mRNA疫苗技術(shù)。

參考文獻(xiàn)：

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