前言

免疫療法的巨大進展改變了目前癌癥治療的模式,然而,鑒于只有少數(shù)患者對免疫檢查點阻斷和其他免疫治療策略有響應(yīng),因此需要更多新技術(shù)來破譯腫瘤細(xì)胞與腫瘤免疫微環(huán)境(TME)成分之間復(fù)雜的相互作用。

腫瘤免疫組學(xué)是指利用免疫基因組學(xué)、免疫蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫生物信息學(xué)等反映腫瘤免疫狀態(tài)的多組學(xué)數(shù)據(jù)對TME進行的綜合研究,它依賴于下一代測序技術(shù)的快速發(fā)展。高通量基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可用于計算免疫細(xì)胞的豐度和預(yù)測腫瘤抗原,然而,由于批量測序代表了異質(zhì)細(xì)胞群的平均特征,因此無法區(qū)分不同的細(xì)胞亞型�；�于單細(xì)胞的技術(shù)能夠通過精確的免疫細(xì)胞亞群和空間結(jié)構(gòu)研究更好地解析TME。此外,基于放射組學(xué)和數(shù)字病理學(xué)的深度學(xué)習(xí)模型在很大程度上有助于腫瘤免疫的研究,這些人工智能技術(shù)在預(yù)測免疫治療反應(yīng)方面表現(xiàn)良好。這些新技術(shù)的進展和突破對癌癥治療具有深遠(yuǎn)意義。

腫瘤免疫微環(huán)境

在過去幾年中對腫瘤免疫的研究進展,使我們對腫瘤的認(rèn)識發(fā)生了根本的改變。腫瘤的定義也從單純的腫瘤細(xì)胞聚集演變?yōu)橐粋�復(fù)雜的器官樣結(jié)構(gòu),由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和周圍的其他基質(zhì)細(xì)胞組成。腫瘤附近的各種細(xì)胞和成分,如免疫浸潤細(xì)胞、血管,細(xì)胞外基質(zhì)等構(gòu)成的結(jié)構(gòu),也稱為腫瘤免疫微環(huán)境,已成為腫瘤學(xué)最熱門的研究課題之一。TME已被證明在癌癥發(fā)生、腫瘤進展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著決定性的作用。

TME包含了極其多樣的免疫細(xì)胞亞群,包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)、粒細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)等。通常,T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞有助于抑制腫瘤生長,而MDSC和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)傾向于抑制抗腫瘤免疫。然而,現(xiàn)有研究已經(jīng)證實,鑒于與腫瘤細(xì)胞的復(fù)雜相互作用,免疫細(xì)胞的特定作用可能會發(fā)生動態(tài)變化,甚至變得完全相反。

總之,各種各樣的免疫細(xì)胞類型,甚至特定免疫細(xì)胞類型的不同功能狀態(tài)都可能對抗腫瘤免疫產(chǎn)生截然相反的效果。因此,這就需要借助最先進的生物信息學(xué)技術(shù),從而在最大程度上系統(tǒng)地描述腫瘤的免疫學(xué)特征,并提供更多的信息來增強我們對腫瘤免疫的理解。

NGS時代的免疫基因組學(xué)

在過去二十年中,包括全基因組測序(WGS)、全外顯子組測序(WES)和RNA測序(RNA seq)在內(nèi)的NGS已成功開發(fā)并應(yīng)用于獲取人類全基因組信息。NGS產(chǎn)生高通量基因組和轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù),為研究多步免疫應(yīng)答奠定了基礎(chǔ)。

量化TME中的免疫細(xì)胞

TME由多種免疫細(xì)胞組成,對于腫瘤免疫細(xì)胞組分的定量,傳統(tǒng)的方法,如流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)(IHC),由于其高成本和低組織可用性,不適用于大規(guī)模分析。隨著NGS的快速發(fā)展,我們能夠通過NGS數(shù)據(jù)估計幾十種免疫細(xì)胞類型的豐度,這些數(shù)據(jù)也被證實是可靠的。這些分析的來源主要是DNA和RNA測序,尤其是后者。關(guān)于RNA序列數(shù)據(jù),計算方法的原理主要分為基因集富集分析(GSEA)和逆卷積。

通常,基于GSEA的代表性算法包括ESTIMATE、xCell和MCP計數(shù)�；�于GSEA的方法的一個共同特點是需要為每個感興趣的免疫細(xì)胞亞群建立特定的基因集。細(xì)胞成分的逆卷積是基于基因表達特征的體組織中細(xì)胞亞型卷積的反向過程。基于逆卷積的工具包括decornaseq、PERT、CIBERSORT、TIMER、EPIC、quanTIseq和deconf．

腫瘤抗原的鑒定

體細(xì)胞DNA突變,包括單核苷酸變異(SNV)和插入和缺失(INDEL),是異常抗原的主要來源。目前,基因組分析工具包(GATK)是通過分析WES、WGS和RNA序列數(shù)據(jù)來識別SNV和INDEL的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。其范圍也在擴大,以涵蓋拷貝數(shù)變異(CNVs)和結(jié)構(gòu)變異(SVs)。

此外,異常肽需要與HLA結(jié)合,以協(xié)助T細(xì)胞受體(TCR)識別,從而引發(fā)免疫反應(yīng)。預(yù)測HLA分型對于識別腫瘤抗原至關(guān)重要。HLA miner和Seq2HLA是用于從NGS數(shù)據(jù)進行HLA分型的兩種早期工具,PHLAT、HLAreporter、SNP2HLA、HLA-HD、optype和HLA-VBSeq在不同癌癥中的四位、六位和八位分辨率表現(xiàn)都相當(dāng)出色。在這些工具中,Polysolver是目前使用低覆蓋率WES數(shù)據(jù)的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)工具之一。

除了識別異常肽和HLA分型外,抗原MHC結(jié)合親和力是腫瘤抗原預(yù)測的下一個重點。許多肽-MHC-I(pMHC-I)親和力預(yù)測工具是基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)訓(xùn)練方法和位置特異性評分矩陣(PSSM),如目前廣泛使用的工具NetMHC和NetMHCpan。而由于MHCII結(jié)合肽長度的多樣性和結(jié)合區(qū)的“開放性”,預(yù)測pMHC II親和力更具挑戰(zhàn)性,可用的pMHC II親和力預(yù)測方法的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于pMHC-I。

單細(xì)胞時代的免疫組學(xué)

盡管利用NGS技術(shù)研究腫瘤免疫的研究極大地促進了腫瘤學(xué)的發(fā)展,但批量測序可能會導(dǎo)致信號稀釋到檢測限以下,并掩蓋單個細(xì)胞的反應(yīng)。這可能會掩蓋許多重要的生物學(xué)現(xiàn)象。直到最近,單細(xì)胞相關(guān)方法的技術(shù)突破徹底改變了我們對腫瘤免疫的理解,并將研究水平從區(qū)域水平過渡到單細(xì)胞水平。

多色流式細(xì)胞術(shù)

多參數(shù)分析在功能上和物理上區(qū)分不同免疫細(xì)胞亞群的能力已促使流式細(xì)胞儀發(fā)展為常規(guī)使用的8參數(shù)流式細(xì)胞儀。此外,隨著技術(shù)的進步,可以測量更多參數(shù)的儀器設(shè)計已經(jīng)實現(xiàn),例如30參數(shù)和50參數(shù)流式細(xì)胞儀。然而,由于更可測量的參數(shù)精度較低,或更高精度可測量的參數(shù)有限,特別是由于熒光染料發(fā)射光譜之間的重疊,這些缺點在一定程度上限制了多色流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用和進一步發(fā)展。

質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)

質(zhì)譜是該領(lǐng)域的一項最新創(chuàng)新,也稱為飛行時間(CyTOF)流式細(xì)胞儀,將流式細(xì)胞儀與質(zhì)譜儀相結(jié)合。與傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀相比,質(zhì)譜儀用金屬同位素而不是熒光團標(biāo)記抗體,然后使用飛行時間檢測器對信號進行量化,該檢測器可檢測至少40個參數(shù),并避免光譜重疊問題。CyTOF已被證實是一種精確的腫瘤組織高維分析方法,用于探索性免疫分析和生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)。

雖然從理論上講,質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)允許我們檢測每個細(xì)胞最多100個參數(shù),但處理速度和通量受到離子飛行的限制。在霧化和電離后,細(xì)胞在預(yù)處理過程中被完全破壞,導(dǎo)致后續(xù)細(xì)胞分類應(yīng)用不可行。此外,關(guān)于測量某些低表達分子特征,CyTOF可能因其低靈敏度而不合適。

光譜流式細(xì)胞術(shù)

光譜流式細(xì)胞術(shù)是促進傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)功效的另一項最新技術(shù)進步。與質(zhì)譜儀不同,光譜流式細(xì)胞儀仍然用熒光染料標(biāo)記抗體,但用色散光學(xué)和測量全發(fā)射光譜的新型探測器取代了傳統(tǒng)光學(xué)和探測器�；�于相同的原理,傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)和光譜流式細(xì)胞術(shù)保持了相當(dāng)好的兼容性,特別是在商業(yè)抗體的可用性方面,但可以更好地消除混淆因素,如光譜重疊,以提高效率。隨著補償技術(shù)的發(fā)展,光譜流式細(xì)胞術(shù)有可能取代多色流式細(xì)胞術(shù)。

單細(xì)胞RNA測序

基于流式細(xì)胞術(shù)的技術(shù)將特定標(biāo)簽與相應(yīng)的細(xì)胞亞群結(jié)合并識別該標(biāo)簽,表明必須在樣本采集之前確定目標(biāo),而最初的目標(biāo)限定限制了從這些技術(shù)中獲得的信息,只能通過這些技術(shù)找到“已知的未知的”。

單細(xì)胞測序技術(shù)的出現(xiàn)將單細(xì)胞領(lǐng)域推向了新的高度。不再受流式細(xì)胞術(shù)等預(yù)定目標(biāo)的限制,可以使用標(biāo)準(zhǔn)NGS協(xié)議對單個細(xì)胞進行測序,以獲得可用于識別“未知”的無偏多組學(xué)分析。

目前,scRNA-seq的應(yīng)用相對其他方法更為成熟,再腫瘤免疫治療領(lǐng)域為我們提供了很多非常有價值的發(fā)現(xiàn)和啟示。然而,微量物質(zhì)放大產(chǎn)生的技術(shù)噪音仍然是最重大的挑戰(zhàn)。如何分離單個細(xì)胞并保持其生物活性,如何解決放大帶來的巨大技術(shù)噪音并提高靈敏度,如何以最低的價格獲得最高數(shù)量的可測量基因,如何更有效地分析數(shù)據(jù),這些都大大提高了單細(xì)胞測序的門檻,限制了它的廣泛應(yīng)用。

免疫組學(xué)與人工智能

人工智能在腫瘤免疫研究中的技術(shù)進展主要涉及以下幾個方面:(1)減輕了人工識別病理切片上免疫浸潤的工作量;(2) 提供了一種替代技術(shù)來識別肉眼難以識別的免疫細(xì)胞亞群和空間結(jié)構(gòu);(3)提供一種非侵入性方法來預(yù)測特定患者的TME特征和對免疫治療的反應(yīng)。

基于深度學(xué)習(xí)方法的腫瘤抗原預(yù)測

破譯腫瘤抗原的第一步是預(yù)測異常肽。除了識別SNV的多種算法外,最近設(shè)計的CN學(xué)習(xí)工具也被設(shè)計用于檢測CNV,表現(xiàn)出良好的性能。關(guān)于HLA分型,Bulik等人生成了一個大型綜合數(shù)據(jù)集,包括各種類型癌癥組織的HLA類型和HLA肽,并公布了可用于訓(xùn)練完整質(zhì)譜深度學(xué)習(xí)模型EDGE的數(shù)據(jù),該模型已在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者中得到驗證。此外,最近開發(fā)了兩種很有前途的計算深度學(xué)習(xí)方法MARIA和MixMHC2pred,大大提高了MHC-II預(yù)測精度。

放射組學(xué)在腫瘤免疫中的應(yīng)用

隨著人工智能在醫(yī)學(xué)影像學(xué)中的發(fā)展,影像已經(jīng)不僅僅是一張圖片,而是一個大規(guī)模的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù),使用AI技術(shù)分析成像數(shù)據(jù)的過程就是放射組學(xué)。應(yīng)用于腫瘤免疫的放射組學(xué)技術(shù)主要用于識別反映免疫浸潤的生物標(biāo)記物,并預(yù)測ICB治療患者的治療反應(yīng)。            

腫瘤免疫中的計算病理學(xué)

病理學(xué)中的AI,或所謂的數(shù)字病理學(xué),通過計算分析,為探索免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用以及癌癥生物學(xué)關(guān)鍵行為之間的聯(lián)系提供了新的見解。

與放射學(xué)相似,數(shù)字病理學(xué)結(jié)合深度學(xué)習(xí)從圖像中挖掘出看不見的信息,使我們能夠在細(xì)胞或分子水平上理解TME。數(shù)字病理學(xué)可能是研究TME結(jié)構(gòu)以及癌癥生物學(xué)和治療之間關(guān)系的一種有希望的方法。

免疫組學(xué)在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

識別ICB的生物標(biāo)志物用于患者分層

作為ICB的一個靶點,IHC檢測到的PD-L1表達水平是第一個發(fā)現(xiàn)的預(yù)測性生物標(biāo)記物,但一些臨床試驗表明ICB對一些PD-L1高表達患者僅具有輕微療效,而ICB也會對PD-L1低表達患者有響應(yīng)。因此,迫切需要其他生物標(biāo)記物來填補這一空白。

2014年,研究人員首次通過WES將腫瘤突變負(fù)荷(TMB)與接受CTLA-4抑制劑治療的患者的臨床生存率聯(lián)系起來。隨后,其他回顧性研究也證明,高TMB與持久的臨床益處相關(guān)。關(guān)于用于評估TMB的方法,由于WES的高成本和復(fù)雜性,FDA批準(zhǔn)了兩個替代NGS平臺,即FoundationOne CDx(F1CDx)和MSKCC可操作癌癥靶點綜合突變譜(MSK-IMPACT),并通過多個癌癥的前瞻性研究進行了驗證。

另一方面,免疫細(xì)胞浸潤,特別是TIL,在免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。為了發(fā)現(xiàn)更理想的治療和預(yù)后生物標(biāo)志物,單細(xì)胞測序被用于鑒定更多的免疫細(xì)胞亞群。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TCF7+記憶樣T細(xì)胞與抗PD1治療后黑色素瘤患者的臨床改善相關(guān),而干細(xì)胞樣TCF1+PD1+T細(xì)胞經(jīng)證實,在ICB治療中有助于腫瘤控制。通過單細(xì)胞測序技術(shù),更多與治療和預(yù)后相關(guān)的T細(xì)胞亞群和功能狀態(tài)被確定。

ACT治療中新抗原的預(yù)測

過繼細(xì)胞療法(ACT)是通過轉(zhuǎn)基因或擴增的自體或異體T細(xì)胞重新回輸?shù)交颊唧w內(nèi),以增強抗腫瘤免疫。免疫組學(xué)主要用于在ACT治療中識別理想的腫瘤抗原。

目前,新抗原特異性TCR-T細(xì)胞尚未進入臨床應(yīng)用,然而,令人欣慰的是,一些病例報告顯示了免疫組學(xué)預(yù)測的結(jié)直腸癌、乳腺癌和膽管癌患者T細(xì)胞識別腫瘤新抗原的有效性。Tran等人對轉(zhuǎn)移性膽管癌患者的樣本進行WGS,確定了26種體細(xì)胞突變。將由突變基因組成的串聯(lián)微基因轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)染到自體APC中,然后將新抗原呈遞APC與患者來源的TIL共培養(yǎng),最終鑒定抗原特異性CD4+Vb22+T細(xì)胞克隆,誘導(dǎo)上皮癌消退。

傳統(tǒng)的基于自體APC和T細(xì)胞共培養(yǎng)的新抗原選擇由于其低通量、高成本和耗時的特性而受到限制。為了消除這些障礙,開發(fā)了更多高通量免疫原性新抗原檢測技術(shù)。Li等人建立了一個基于trogocytosis的平臺,在該平臺中,當(dāng)TCR和pMHC結(jié)合時,表面標(biāo)記蛋白就從APC轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞。因此,可以通過分析標(biāo)記蛋白陽性細(xì)胞來識別理想的新抗原。未來,這些新興的免疫基因組學(xué)技術(shù)將實現(xiàn)高通量新抗原選擇。

為個體化腫瘤疫苗選擇新抗原

免疫組學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于臨床研究中的疫苗開發(fā)。一般來說,用于生成個性化疫苗的新抗原是通過分析腫瘤和正常組織的WES和RNA序列,并通過算法(如NetMHCpan)預(yù)測有效表位來識別的。

與ACT相似,腫瘤疫苗開發(fā)的關(guān)鍵參數(shù)是理想的新抗原鑒定。為了提高新抗原預(yù)測的準(zhǔn)確性和免疫原性新表位選擇管道,免疫組學(xué)技術(shù)在這些方面做著不懈的努力。在最近的一項研究中,Wells等人匯編了所有新抗原預(yù)測和選擇方法,并提供了一個全新的候選測定管道,其中包括MHC呈遞和T細(xì)胞識別的14個免疫原性特征。本研究為提高腫瘤疫苗的療效和過繼性細(xì)胞治療奠定了堅實的基礎(chǔ)。

小結(jié)

近年來,伴隨著免疫組學(xué)領(lǐng)域新興技術(shù)的巨大飛躍,我們現(xiàn)在能夠以前所未有的深度解析腫瘤免疫。

在批量測序時代,使我們能夠更好地探索腫瘤免疫細(xì)胞的個體浸潤模式,以及異常肽的預(yù)測、HLA分型和腫瘤抗原MHC結(jié)合親和力的預(yù)測,使用免疫組學(xué)技術(shù)預(yù)測腫瘤抗原已在臨床前和臨床研究中證明了其可靠的功效。

此外,隨著單細(xì)胞免疫相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,從多色流式細(xì)胞術(shù)到CyTOF,單細(xì)胞腫瘤免疫圖譜幫助我們進行免疫細(xì)胞亞群分類,以破譯TME成分。人工智能的出現(xiàn)也為免疫組學(xué)的發(fā)展提供了新的方向。

隨著免疫組學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展,可持續(xù)發(fā)展需要考慮幾個問題。首先,盡管已經(jīng)實施了許多質(zhì)量控制和改進算法原理的方法,但這些技術(shù)的有效性仍有待提高。特別是在腫瘤抗原預(yù)測、單細(xì)胞測序和空間上分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面,技術(shù)噪音和混雜因素阻礙了后續(xù)分析。其次,期待更具成本效益、更易獲取和更自動化的技術(shù)出現(xiàn),從而徹底改變學(xué)科的發(fā)展。第三,我們還期望研究人員充分利用現(xiàn)有技術(shù)探索腫瘤免疫,促進臨床轉(zhuǎn)型。

盡管還有很多工作要做,但免疫組學(xué)很可能在未來的腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域占據(jù)主導(dǎo)地位,其臨床價值無疑將極大地促進該學(xué)科在免疫組學(xué)、單細(xì)胞和人工智能領(lǐng)域的發(fā)展。

參考文獻:

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