前言

基因治療是目前最火熱的治療領(lǐng)域之一,因?yàn)樗�針對的是疾病的潛在致病原因而不僅僅是癥狀。目前,我們在基因治療開發(fā)方面取得了巨大進(jìn)展,在可用的基因治療平臺中,基于腺相關(guān)病毒(AAV)的載體顯然已成為最有希望的基因傳遞載體之一。

腺相關(guān)病毒在基因治療方面的發(fā)展勢頭越來越大,越來越多的臨床試驗(yàn)將其用于各種治療。事實(shí)上,截至目前監(jiān)管機(jī)構(gòu)只批準(zhǔn)了三種體內(nèi)基因治療方法用于臨床,這三種療法都是基于AAV載體的。2012年,歐洲藥品管理局(EMA)首次批準(zhǔn)使用AAV載體治療脂蛋白脂肪酶缺乏癥,但由于需求不足,目前已不再上市。此外,FDA批準(zhǔn)的基于AAV的基因療法包括Sparktherapeutics的Luxturna和Avexis的藥物Zolgensma,分別用于治療遺傳性視網(wǎng)膜疾病和脊髓性肌萎縮癥。AAV因其較低的免疫原性和位點(diǎn)特異性整合能力被認(rèn)為具有更好的安全性。然而,抗AAV的中和抗體在大多數(shù)人群中普遍存在,這限制了AAV的系統(tǒng)應(yīng)用。

AAV的歷史與病毒學(xué)

AAV最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年代,被認(rèn)為是腺病毒培養(yǎng)的污染物。然而,隨著發(fā)現(xiàn)AAV只有在腺病毒存在下才能復(fù)制,以及后來的單純皰疹病毒1型(HSV-1)的存在,腺病毒和AAV之間的聯(lián)系很快建立起來。在確定AAV可以轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞后,研究人員開始生產(chǎn)重組AAV(rAAV)。含有腺病毒DNA的質(zhì)粒可以獨(dú)立于輔助病毒復(fù)制AAV。這一發(fā)現(xiàn)推動了該領(lǐng)域的發(fā)展,并真正開啟了AAV的基因治療領(lǐng)域。

AAV是一種小的、無包膜的細(xì)小病毒,在20-25nm的衣殼中基因組大小為?4．7kbp�；�因組分為復(fù)制(REP)和衣殼蛋白質(zhì)(CAP)的兩個編碼區(qū),基因組兩端都有反向重復(fù)序列(ITR)。REP編碼與感染、整合和復(fù)制有關(guān)的四種蛋白質(zhì),Rep40、Rep52、Rep68和Rep78,而CAP編碼三種蛋白,VP1,VP2和VP3,它們分別以1:1:10的比例組成AAV的60-mer衣殼。VP3是最豐富的,構(gòu)成了外殼結(jié)構(gòu)的外部,而VP1和VP2構(gòu)成內(nèi)部。                          

AAV不能獨(dú)立復(fù)制,只有在輔助病毒(如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒)存在時,才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染,否則只能建立溶源性潛伏感染。AAV將其基因組整合到19號染色體上的一個特定位置,即AAVS1,或在染色體外獨(dú)立復(fù)制。AAV是非致病性的,即使在其自然狀態(tài)下也不會引起任何疾病;此外,它沒有系統(tǒng)的固有性免疫反應(yīng)�？偣舶l(fā)現(xiàn)了12種天然的AAV衣殼血清型,并命名為AAV1-AAV12,它們顯示出優(yōu)先與體內(nèi)特定組織結(jié)合的特性。

AAV不僅能感染活躍分裂的細(xì)胞,而且能感染靜止的細(xì)胞,這使得它對許多病毒和非病毒載體對基因傳遞不敏感的細(xì)胞群特別有價值,例如視網(wǎng)膜細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞。AAV感染靜止細(xì)胞的自然能力促進(jìn)了基因治療的許多顯著進(jìn)步,例如FDA批準(zhǔn)的治療Leber先天性黑朦的Luxturna(Spark Therapeutics)。

臨床上批準(zhǔn)的基于AAV的基因治療藥物

在過去的20年中,基于AAV載體的基于治療在臨床轉(zhuǎn)化中的相關(guān)性不斷提高,目前占全球基因治療臨床試驗(yàn)的8．1%。                      

第一個批準(zhǔn)在歐洲臨床使用的基于AAV的基因治療藥物是alipogene tiparvovec(AT),用于治療脂蛋白脂酶缺乏癥(LPLD),這是一種罕見的常染色體隱性疾病。該藥物于2012年獲得批準(zhǔn),商品名為Glybera。AT基因療法提供LPL基因的變體,LPLS447X,以糾正LPL患者LPL的功能。在III期臨床試驗(yàn)中,給藥AT后14周,低脂飲食后乳糜微粒的峰值水平降低了79%。

目前有17種美國FDA批準(zhǔn)的基因療法,包括AAV載體voretigene neparvovec rzyl(VN),由Spark Therapeutics于2017年開發(fā),商品名為Luxturna。VN包含一個包裹RPE6基因的AAV2,用于治療雙等位基因RPE65相關(guān)的視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良癥,一種罕見的遺傳性疾病,導(dǎo)致視功能受損,隨年齡增長而下降,最終導(dǎo)致失明。在2012年進(jìn)行的III期臨床試驗(yàn)中(NCT00999609),Leber先天性黑朦2型患者接受視網(wǎng)膜下注射VN 1年后,65%的參與者獲得最大改善。在VN獲批之前,還沒有治療視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的藥物。

2019年獲得FDA批準(zhǔn)的第二種基于AAV的基因療法是Onasemogene abeparvovec xioi(OA),由AveXis開發(fā),商品名為Zolgensma。OA利用表達(dá)功能性SMN1轉(zhuǎn)基因的AAV9治療2歲以下兒童的I型脊髓性肌萎縮癥(SMA1)。SMA1的特點(diǎn)是腦干和脊髓的運(yùn)動神經(jīng)元丟失,導(dǎo)致運(yùn)動功能嚴(yán)重受損,并最終因呼吸衰竭死亡。它是導(dǎo)致嬰兒死亡的最常見單基因遺傳性疾病。在2017年一項(xiàng)名為STR1VE的三期臨床試驗(yàn)中(NCT03306277),接受治療后, 91%的患者在14個月時仍無需永久性呼吸支持,50%的患者在18個月時能夠獨(dú)立靜坐。

AAV應(yīng)用的挑戰(zhàn)

大多數(shù)成功的用于臨床前和臨床研究的AAV僅限于天然的衣殼血清型,但這些AAV血清型在臨床上的廣泛應(yīng)用存在明顯的局限性�？笰AV的中和抗體的存在仍然是全身輸送的一個重要障礙,這些中和抗體干擾AAV進(jìn)入靶細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和細(xì)胞核內(nèi)的解包裝,從而阻止了轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了更好地了解接觸AAV所產(chǎn)生的免疫反應(yīng),已經(jīng)進(jìn)行了一些研究,檢查了產(chǎn)生的IgG亞類,發(fā)現(xiàn)它們主要是IgG1。流行病學(xué)研究表明,在30-60%的人群中可發(fā)現(xiàn)血清陽性率不同的中和抗體。這些中和抗體中最流行的是針對AAV2的,其次是AAV1。

AAV介導(dǎo)的基因治療的另一個問題是基因組(4．7kbp)的大小限制,包括ITRs,給轉(zhuǎn)入的基因只留下一個?4．5kbp的大小空間,這將其靶向適應(yīng)癥縮小到只能是那些小片段轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。

克服中和抗體的解決方案

工程化AAV

AAV可以通過衣殼修飾、表面偶聯(lián)和封裝進(jìn)行設(shè)計,以解決天然AAV的局限性。理論上,克服已有NAB挑戰(zhàn)的最吸引人的方法是將突變引入AAV衣殼,從而阻止NAB的結(jié)合。已經(jīng)證明將點(diǎn)突變引入AAV2衣殼可以減弱這些突變病毒對中和抗體的敏感性。然而,這些位點(diǎn)中的許多對AAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)是必不可少的,因此在不損害其功能的前提下對其進(jìn)行修飾具有挑戰(zhàn)性。

對于大多數(shù)病毒,也包括AAV,在所有針對病毒的中和抗體中,很大一部分是針對受體結(jié)合域的。因此,受體結(jié)合域的突變可能是改善中和的最佳方法,但受體結(jié)合域的突變也很可能影響病毒的導(dǎo)向性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

此外,使用聚合物、脂類和水凝膠的表面栓系和包封都能夠保護(hù)AAV衣殼免受nAbs的侵襲,使其能夠逃避免疫系統(tǒng)的檢測和抗體反應(yīng)。

血漿置換

“傳統(tǒng)”血漿置換術(shù)可以去除所有免疫球蛋白,在從患者血清中去除大多數(shù)NAb方面顯示出一定的前景,盡管只適用于NAb滴度較低的患者。此外,去除所有免疫球蛋白也有其自身的缺點(diǎn)。最近,有研究已經(jīng)證明,通過將IVIG或人血清與共價偶聯(lián)AAV顆粒的珠子孵育,可以在體外去除中和抗體/因子。在NAb滴度較高的動物中,使用這種珠粒進(jìn)行血采可以完全恢復(fù)肝轉(zhuǎn)導(dǎo),而在沒有血采的動物中,肝轉(zhuǎn)導(dǎo)幾乎不存在。

最近,有研究利用了imlifidase(IdeS),一種鏈球菌胱氨酸蛋白酶,可以將IgG切割成F(ab')2片段和Fc。用IDE處理IVIG可在24小時的潛伏期后完全消化總IgG和抗AAV8IgG。

小結(jié)

已有的抗AAV中和抗體對于AAV基因治療來說是一個棘手的問題,因?yàn)樗鼈儠��?yán)重限制可能受益于AAV基因治療的患者群體。在過去幾年中,在克服這一巨大障礙方面取得了重大進(jìn)展,工程化的AAV可以解決這些問題,同時提供了額外的好處。此外,IgG裂解蛋白酶特別適合于使用已有抗AAV抗體的AAV基因治療患者。

隨著全球市場上臨床認(rèn)可產(chǎn)品的出現(xiàn),以及越來越多正在進(jìn)行的成功臨床試驗(yàn),AAV正處于基因治療的前沿,進(jìn)一步的技術(shù)進(jìn)步還需要推進(jìn)更多的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證,但AAV已經(jīng)在未來的基因治療中展現(xiàn)出廣闊的前景。

參考文獻(xiàn):

1．Anti-AAV Antibodies in AAV Gene Therapy:Current Challenges and Possible Solutions． Front Immunol． 2021; 12: 658399．

2． Synthetically Engineered Adeno-Associated Virus for Efficient,Safe, and Versatile Gene Therapy Applications． ACS Nano． 2020 Oct 19．