前言

過(guò)繼轉(zhuǎn)移嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞是一項(xiàng)強(qiáng)有力的技術(shù)，它徹底改變了免疫治療的方式。其在難治性和復(fù)發(fā)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤中完全和長(zhǎng)期的療效令人印象深刻，這也為實(shí)體腫瘤的治療開(kāi)辟了新的可能性。然而，細(xì)胞治療的廣泛應(yīng)用受到了T細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用病毒載體自身局限的阻礙。在mRNA疫苗和CRISPR／Cas9精準(zhǔn)基因編輯的時(shí)代，新的無(wú)病毒T細(xì)胞工程化方法正在成為下一代CAR－T細(xì)胞制造的更通用、靈活和可持續(xù)的替代方法。

病毒載體CAR－T細(xì)胞的局限

迄今為止，臨床試驗(yàn)中批準(zhǔn)或研究的大多數(shù)CAR－T細(xì)胞治療都是利用病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體。病毒載體是具有高效基因轉(zhuǎn)移和長(zhǎng)期應(yīng)用歷史的標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng)，已經(jīng)證明了在過(guò)繼性T細(xì)胞治療的安全性。

然而，病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)長(zhǎng)基因的能力受到衣殼的限制。病毒衣殼直徑大約為100nm，通常不能容納超過(guò)8－9 kb的基因。然而，隨著CAR－T技術(shù)的更新迭代，需要轉(zhuǎn)入額外的激活原件或者不同特異性的CAR，實(shí)現(xiàn)更高的藥效、安全性和適用性。

此外，臨床應(yīng)用的病毒生產(chǎn)通常需要兩到三周的時(shí)間，在GMP條件下和生物安全2級(jí)（BSL2）設(shè)施中進(jìn)行，需要經(jīng)過(guò)熟練培訓(xùn)的員工。這種高成本、復(fù)雜性以及個(gè)性化治療的需要最終影響了CAR－T產(chǎn)品的價(jià)格，可能達(dá)到每人數(shù)十萬(wàn)美元，使普通的患者望而生畏。

最后，病毒載體具有固有的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，這是由對(duì)載體編碼表位的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)引起的，這可能限制轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的效力和持久性。

T細(xì)胞工程化的非病毒方法

諾貝爾獎(jiǎng)獲得者遺傳學(xué)家芭芭拉·麥克林托克Barbara McClintock在20世紀(jì)40年代研究玉米籽粒顏色變異時(shí)，最初發(fā)現(xiàn)了基因組中存在移動(dòng)序列。玉米中的這些“跳躍基因”當(dāng)時(shí)被稱為轉(zhuǎn)座因子（TE）或轉(zhuǎn)座子。

TE分為兩類，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和DNA轉(zhuǎn)座子。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子使用RNA中間體通過(guò)復(fù)制粘貼機(jī)制移動(dòng)，代表人類基因組中最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)座子類。DNA轉(zhuǎn)座子通過(guò)DNA中間體移動(dòng)，并用于基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用。大多數(shù)DNA轉(zhuǎn)座子家族都有一個(gè)編碼轉(zhuǎn)座酶基因的元件，其兩側(cè)是反向末端重復(fù)序列（ITR）。轉(zhuǎn)座酶識(shí)別并結(jié)合整合到ITRs中的元件，催化將轉(zhuǎn)座因子從其原始位置切除，并將其整合到基因組中的另一個(gè)位置。目前，廣泛使用的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，包括Sleeping Beauty（SB）和piggyBac（PB）。非病毒轉(zhuǎn)座子載體具有多功能性、低免疫原性和易于生產(chǎn)的特性。然而，它們通常比病毒的轉(zhuǎn)染效率低。

mRNA的非病毒傳遞通常通過(guò)電穿孔或納米顆粒實(shí)現(xiàn)。一旦進(jìn)入細(xì)胞且不需要到達(dá)細(xì)胞核，mRNA被翻譯成編碼的蛋白質(zhì)，并且通常在2－4次細(xì)胞分裂后丟失，這種方法避免了整合載體相關(guān)的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)，使該策略成為CAR－T細(xì)胞中一個(gè)安全的良好方法。

睡美人轉(zhuǎn)座子

在長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化“睡眠”后醒來(lái)，魚(yú)類基因組中發(fā)現(xiàn)的SB，成為第一個(gè)在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中顯示活性的轉(zhuǎn)座子，從而為基因治療開(kāi)辟了新的視野�；�于經(jīng)典的Tc1／mariner DNA II類TE，這些“跳躍”單元能夠通過(guò)剪切粘貼機(jī)制從一個(gè)基因組位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)基因組位置。SB載體由兩個(gè)功能組分組成：轉(zhuǎn)座子DNA，它攜帶有ITR側(cè)翼的感興趣基因，以及SB轉(zhuǎn)座酶，它識(shí)別ITR序列，并將轉(zhuǎn)基因從供體DNA動(dòng)員到基因組內(nèi)的受體位點(diǎn)。

與病毒系統(tǒng)相比，這種策略的一大優(yōu)勢(shì)是更大的裝載能力。插入物的大小與轉(zhuǎn)座機(jī)制的效率呈負(fù)相關(guān)。最佳裝載大小不高于6kb。但其升級(jí)版本包括兩個(gè)完整的轉(zhuǎn)座子單元，可以將負(fù)載增加到11kb，從而擴(kuò)充了基于SB載體的克隆能力。此外，當(dāng)與細(xì)菌人工染色體（BACs）結(jié)合時(shí)，SB在人類胚胎干細(xì)胞中可以傳遞高達(dá)100 kb的轉(zhuǎn)基因。

在臨床應(yīng)用方面，Cooper等人的團(tuán)隊(duì)首次將SB工程化抗CD19 CAR－T細(xì)胞應(yīng)用于臨床試驗(yàn)，兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)（NCT00968760、NCT01497184）證實(shí)了SB工程化抗CD19 CAR－T細(xì)胞在26例B－ALL和非霍奇金淋巴瘤患者自體或異基因造血干細(xì)胞移植（HSCT）后作為輔助治療的安全性。

此外，目前還有正在美國(guó)和歐洲使用SB平臺(tái)進(jìn)行的CAR－T研究。UltraCAR－T平臺(tái)基于非病毒系統(tǒng)通過(guò)SB載體傳遞多個(gè)基因，利用該平臺(tái)，正在CD33 CAR和mbIL15（PRGN－3006）的自體細(xì)胞，用于治療r／r急性髓系白血病和高危骨髓增生異常綜合征（MDS）。目前，PRGN－3006正在一項(xiàng)劑量遞增／擴(kuò)展研究（NCT03927261）中，評(píng)估在r／r急性髓系白血病核高危MDS成年患者中的安全性。初步數(shù)據(jù)表明，PRGN－3006輸注具有良好的耐受性，在接受淋巴濾過(guò)治療的患者中獲得50％的緩解率，與CAR－T細(xì)胞擴(kuò)增和持續(xù)性相關(guān)。

PiggyBac轉(zhuǎn)座子

與SB載體一樣，PB系統(tǒng)由PB轉(zhuǎn)座酶（PBase）構(gòu)成，其形式為mRNA或DNA，以及攜帶所需基因的單獨(dú)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。PB轉(zhuǎn)座子載體的設(shè)計(jì)以單個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）為特征，其兩側(cè)是ITR，PB中的ITR具有特征性的不對(duì)稱性。轉(zhuǎn)座酶識(shí)別轉(zhuǎn)座子兩側(cè)的ITR，并通過(guò)剪切粘貼機(jī)制將轉(zhuǎn)基因整合到基因組DNA中。PB在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有比SB更高的轉(zhuǎn)座子動(dòng)員轉(zhuǎn)座活性，比病毒載體具有更大的裝載能力（高達(dá)14 kb），并允許通過(guò)設(shè)計(jì)多順?lè)醋雍羞M(jìn)行多個(gè)轉(zhuǎn)基因傳遞。

目前，越來(lái)越多的臨床前數(shù)據(jù)支持基于PB的CAR－T制造平臺(tái)的可行性和安全性，這使得該系統(tǒng)能夠進(jìn)入臨床試驗(yàn)。在澳大利亞開(kāi)展的CARTELL試驗(yàn)是一項(xiàng)I期臨床研究（ACTRN12617001579381），旨在研究通過(guò)PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)獲得的供體衍生抗CD19 CAR－T細(xì)胞的療效和安全性。早期結(jié)果表明，其活性類似于用高應(yīng)答率病毒載體生成的抗CD19 CAR－T細(xì)胞。另外，分別在日本（UMIN000030984）和中國(guó)（NCT04289220）進(jìn)行的兩項(xiàng)I期研究正在調(diào)查使用PB系統(tǒng)制造的抗CD19 CAR－T細(xì)胞的可行性和安全性。在日本的研究中，到目前為止，沒(méi)有一名患者顯示出劑量限制性毒性。一名患者表現(xiàn)出持續(xù)9個(gè)月的B細(xì)胞再生障礙。

雖然轉(zhuǎn)座子工程化的CAR－T細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中都處于初始階段，但一些已經(jīng)表現(xiàn)出一定的臨床療效�？笲CMA CAR－T細(xì)胞（P－BCMA－101）通過(guò)PB平臺(tái)設(shè)計(jì)，為了改善轉(zhuǎn)座，其在研究過(guò)程中改變了制造工藝，包括使用納米質(zhì)粒，以減少骨架尺寸并使ITR更接近。細(xì)胞產(chǎn)物顯示出高組成的記憶干T細(xì)胞（TSCM）。90名R／R MM患者接受了P－BCMA－101治療，早期結(jié)果顯示，初始劑量遞增的總有效率（ORR）為57％，與利妥昔單抗聯(lián)合使用的ORR為73％，毒性很低（NCT03288493）。

mRNA

30多年前，Malone的開(kāi)創(chuàng)性研究表明，與脂質(zhì)混合的RNA可以被人類細(xì)胞吸收并從中翻譯蛋白質(zhì)。從那時(shí)起，RNA就被用于基因工程的多個(gè)方面，例如恢復(fù)突變基因的功能表達(dá)，敲除基因以沉默表達(dá)，修改細(xì)胞表型或編碼抗原。RNA成功表達(dá)蛋白質(zhì)取決于其穩(wěn)定性和翻譯效率。這些特征由順式作用元件決定，例如5’帽結(jié)構(gòu)、polyA尾、編碼序列的組成以及可能存在于分子5’和3’端的非編碼區(qū)域。

RNA適合多種細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，包括電穿孔、陽(yáng)離子脂質(zhì)和陽(yáng)離子聚合物。已經(jīng)有許多體外和體內(nèi)臨床前研究，通過(guò)mRNA將CAR引入T細(xì)胞，用于在血液腫瘤和實(shí)體瘤的模型系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)試。雖然基于mRNA的治療被證明可以減少靶向效應(yīng)、降低毒性并緩解整合相關(guān)的安全性問(wèn)題，但蛋白質(zhì)表達(dá)的瞬時(shí)性在這些應(yīng)用中也是一個(gè)缺點(diǎn)。

淋巴細(xì)胞遺傳修飾的另一種方法是以DNA的形式將感興趣的轉(zhuǎn)基因與編碼轉(zhuǎn)座酶的RNA一起轉(zhuǎn)染。當(dāng)與編碼目的基因的DNA載體一起共轉(zhuǎn)導(dǎo)到靶細(xì)胞時(shí)，以mRNA形式編碼轉(zhuǎn)座酶有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的瞬時(shí)性降低了轉(zhuǎn)座子重新切除和重新整合引起的二次轉(zhuǎn)座事件的發(fā)生率；其次，這種方法可以精確滴定SB mRNA和CAR DNA的比率，以實(shí)現(xiàn)持久整合。

從mRNA瞬時(shí)表達(dá)CAR的潛在安全優(yōu)勢(shì)可能在血液學(xué)和實(shí)體瘤環(huán)境中提供較低的毒性。已有臨床研究對(duì)以CD123和CD19為靶點(diǎn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤以及以間皮素和c－Met為靶點(diǎn)的實(shí)體腫瘤進(jìn)行測(cè)試。雖然已有的研究報(bào)告顯示基于mRNA的CAR－T細(xì)胞是安全的，通常沒(méi)有嚴(yán)重的不良事件，但一個(gè)共同點(diǎn)是需要重復(fù)給藥3－6個(gè)高劑量。需要多次輸注高劑量的mRNA CAR－T細(xì)胞很可能與缺乏轉(zhuǎn)基因細(xì)胞持久性有關(guān)，旨在延長(zhǎng)這些患者體內(nèi)活動(dòng)的持續(xù)時(shí)間，但重復(fù)給藥可能會(huì)導(dǎo)致其他并發(fā)癥。

非病毒性CAR－T細(xì)胞治療的未來(lái)

納米載體

為了應(yīng)對(duì)未來(lái)的挑戰(zhàn)，除了轉(zhuǎn)座子平臺(tái)外，基因工程的另一個(gè)非病毒工具是納米載體，納米載體的使用正在成為一種可能的解決方案，以克服目前基因傳遞中的障礙，例如毒性和低轉(zhuǎn)染效率。

在納米技術(shù)的最新進(jìn)展中，作為最前沿的發(fā)現(xiàn)之一，Bozza等人開(kāi)發(fā)了一種非整合DNA納米載體，能夠生成在體外和體內(nèi)都具有活性的CAR－T細(xì)胞。該平臺(tái)不含病毒成分，能夠在分裂細(xì)胞的細(xì)胞核中進(jìn)行額外的染色體復(fù)制，在不需整合的情況下維持持續(xù)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。此外，它還具有非病毒載體的所有優(yōu)點(diǎn)：非免疫原性、簡(jiǎn)單、多功能且生產(chǎn)成本低廉。

新型生物材料

另一方面，通過(guò)使用開(kāi)發(fā)的新型生物材料來(lái)改善CAR－T細(xì)胞的分離、激活和基因修飾，正在取得進(jìn)展。一個(gè)例子是使用合成DNA適配體和互補(bǔ)逆轉(zhuǎn)技術(shù)，允許從PBMC中分離出高純度和高產(chǎn)量的無(wú)標(biāo)記CD8＋T細(xì)胞。這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以通過(guò)具有不同特異性的適配體在單個(gè)分離步驟中分離多個(gè)不同的T細(xì)胞群。

基因編輯

基因編輯和靶向敲除分別依賴于宿主DNA雙鏈斷裂（DSB）修復(fù)和同源定向修復(fù)（HDR）過(guò)程，HDR通常在原代細(xì)胞中發(fā)生頻率較低，并且僅限于小的轉(zhuǎn)基因，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率較低。為了更高效地提供DNA插入，CRISPR／Cas9最近與轉(zhuǎn)座子結(jié)合，以提高RNA引導(dǎo)整合的效率，使用轉(zhuǎn)座酶催化整合。為此，有研究小組進(jìn)行了將CRISPR／Cas9與SB轉(zhuǎn)座子結(jié)合的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，它們適用于未來(lái)的非病毒臨床應(yīng)用。識(shí)別和降低基因組重排和易位風(fēng)險(xiǎn)的方法可以允許在免疫治療中進(jìn)一步開(kāi)發(fā)基因編輯的潛在臨床應(yīng)用。

小結(jié)

迄今為止，成功的CAR－T細(xì)胞治療都與用病毒載體工程化的T細(xì)胞有關(guān)。然而，復(fù)發(fā)、制造過(guò)程的復(fù)雜性以及這些技術(shù)在包括實(shí)體瘤在內(nèi)的其他疾病中的應(yīng)用，需要更復(fù)雜的設(shè)計(jì)和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)來(lái)適應(yīng)這些挑戰(zhàn)。為了填補(bǔ)這些空白，非病毒技術(shù)正在不斷取得進(jìn)展，可以肯定的是，未來(lái)很快就會(huì)看到它們?cè)贑AR－T細(xì)胞治療方面的更多應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

1．The Past， Present， and Future of Non－ViralCAR T Cells． Front Immunol．2022； 13： 867013．

       原文標(biāo)題 : 非病毒性CAR-T的過(guò)去、現(xiàn)在和未來(lái)