前言

免疫檢查點抑制劑的出現(xiàn)在腫瘤免疫治療領(lǐng)域取得了巨大的成功，但大多數(shù)患者仍然未能獲得理想的臨床反應(yīng)。人們提出了許多關(guān)于免疫治療抵抗的解釋，包括低抑制性受體（IR）配體表達，新表位的低免疫原性，高腫瘤負荷與炎癥反應(yīng)比以及免疫排斥等。

檢查點阻斷療法的廣泛作用機制是通過IRs逆轉(zhuǎn)固有的T細胞抑制。這些藥物干擾了腫瘤微環(huán)境（TME）中CD8＋T細胞表達的IRs與相應(yīng)配體的結(jié)合，從而促進了效應(yīng)T細胞細胞因子的產(chǎn)生和T細胞對刺激的反應(yīng)增殖。另一方面，IR阻斷對TME中免疫抑制細胞（尤其是Treg細胞）功能的細胞內(nèi)在影響值得進一步研究。盡管CTLA－4、TIGIT、和TIM標記了更多抑制性的Treg細胞，但PD1和LAG3的作用是模棱兩可的，并且可能與具體情況有關(guān)。最近的一篇論文表明，抗PD1治療可使治療中進展過度的患者體內(nèi)的PD1＋Treg細胞恢復(fù)活力。因此，對于該領(lǐng)域來說，檢查點阻斷如何協(xié)調(diào)促進CD8＋T細胞激活和加強Treg細胞抑制之間的平衡是至關(guān)重要的。

近年來，神經(jīng)纖毛蛋白－1（neuronilin－1，NRP1）因其強大的雙重功能：增強Treg細胞抑制和限制CD8＋T細胞的持久反應(yīng)，在免疫腫瘤學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。盡管最初被認為是一種Treg細胞標志物，新的研究表明NRP1不僅對TME中固有的Treg細胞穩(wěn)定性是必需的，而且它還顯著地抑制CD8＋T細胞的抗腫瘤功能。另外，它在髓系細胞亞群中也高度表達，但其在這方面的功能不太明確。已有的臨床前結(jié)果進一步證明NRP1拮抗作用與已建立的免疫療法相結(jié)合的可行性。NRP1在TME中作為一個關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)劑具有誘人的開發(fā)前景。

NRP1的基礎(chǔ)生物學(xué)

神經(jīng)纖毛蛋白（neuronilins，NRPs）是一種單次跨膜、非酪氨酸激酶表面糖蛋白，在所有脊椎動物中都存在，在物種間高度保守。已知存在兩種同源的NRP亞型，即NRP1和NRP2，由不同的基因編碼，這兩種NRP最初被發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)元粘附分子。后來發(fā)現(xiàn)它們與血管生物學(xué)有關(guān)，正常胚胎血管發(fā)育需要NRP1和NRP2參與小淋巴管和毛細血管的形成。過去10年的研究表明，NRP是一種多功能蛋白質(zhì)，參與除神經(jīng)和血管發(fā)育以外的多種生物過程，其中NRP1起在免疫和腫瘤發(fā)生中起主要作用。

NRP1蛋白由一個長的N端胞外結(jié)構(gòu)域組成，接著是一個跨膜區(qū)和一個由43－44個氨基酸組成的非常短的胞內(nèi)區(qū)。細胞外結(jié)構(gòu)域由三個主要片段組成，即兩個CUB（補體C1r／C1s，Uegf，骨形態(tài)發(fā)生蛋白1）結(jié)構(gòu)域（表示為a1／a2）和兩個凝血因子V／VIII結(jié)構(gòu)域（表示為FV／VIII或b1／b2），然后是MAM（與meprin蛋白酶同源，A5抗原，受體酪氨酸磷酸酶μ和К）結(jié)構(gòu)域（表示為“c”）。CUB結(jié)構(gòu)域是連接信號素配基所必需的，而FV／VIII結(jié)構(gòu)域負責(zé)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的結(jié)合以及不同配體（如信號素和VEGF）的對接位點。已知MAM結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)受體的同源二聚或異源二聚。盡管最初人們認為NRP1是一個非信號受體，因為它的胞內(nèi)區(qū)很短，但后來發(fā)現(xiàn)c端保守的PDZ（PSD－95／Dlg／ZO－1同源性）結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序（SEA）與GAIP相互作用蛋白c－末端／synectin結(jié)合，后者介導(dǎo)細胞內(nèi)信號傳遞和受體內(nèi)化。

NRP1能夠與廣泛的配體結(jié)合，解釋了其多樣的生物學(xué)功能。NRP1首先被確定為分泌的III類信號素的共同受體，如信號素3A（Sema3A），后來發(fā)現(xiàn)NRP1與多種生長因子結(jié)合，最顯著的是VEGF1，以及其他包括轉(zhuǎn)化生長因子β、血小板衍生生長因子C和D、和C－Met。有趣的是，最近的研究表明，NRP1還與細胞外microRNA／AGO2復(fù)合物結(jié)合并促進其內(nèi)部化，增加了NRP1調(diào)節(jié)細胞功能的另一種機制。

免疫系統(tǒng)中的NRP1

髓系細胞

NRP1在人類和小鼠的中樞神經(jīng)和血管系統(tǒng)中廣泛表達于多種組織和細胞中，而NRP1在免疫系統(tǒng)中的表達受到更多的限制和調(diào)節(jié)。NRP1被鑒定為人類樹突狀細胞（DC）的標志物，稱為血液DC抗原4（BDCA4，或CD304），在所有漿細胞樣DC（pDCs）中均有表達。pDCs被稱為“專業(yè)的”I型干擾素（IFN）產(chǎn)生細胞型，當(dāng)用抗NRP1抗體治療時，顯示人類pDCs病毒感染時IFN－α釋放減少，提示NRP1在抗病毒免疫中具有免疫調(diào)節(jié)作用。其他表達NRP1的抗原呈遞細胞（APC）包括單核細胞和巨噬細胞，尤其是幾種組織內(nèi)的巨噬細胞，例如小膠質(zhì)細胞和脂肪組織巨噬細胞（ATM）。單核細胞／巨噬細胞NRP1的表達通常被認為是促血管生成和抗炎的，因此有助于組織重塑和傷口愈合。在最近的一份報告中，發(fā)現(xiàn)NRP1＋ATM可通過維持葡萄糖動態(tài)平衡來預(yù)防肥胖和代謝綜合征。

T細胞

在適應(yīng)性免疫中，NRP1被認為是小鼠胸腺源性Treg（tTreg）細胞的標記物，盡管這并不適用于人類Treg細胞。相反，NRP1在靜止的CD4＋輔助性T細胞和CD8＋T細胞上表達非常低。在抵抗實驗性自身免疫性腦炎（EAE）的小鼠模型中，NRP1在EAE耐受性CD4＋T細胞（同時在Foxp3＋和Foxp3－）中上調(diào)，并在功能上促成其抑制表型。其他報告有NRP1表達的T細胞亞群包括T濾泡輔助細胞和IL－17表達的不變自然殺傷性T細胞。最后，NRP1在人類胸腺上皮細胞（TEC）上結(jié)構(gòu)性表達，在TEC與胸腺細胞接觸期間上調(diào)未成熟胸腺細胞，隨后被Sema3A阻斷以引導(dǎo)胸腺細胞遷移。

髓系細胞－T細胞相互作用

NRP1也由從人類外周血中分離出來的傳統(tǒng)樹突狀細胞表達，它可能通過同型相互作用介導(dǎo)樹突狀細胞和T細胞之間免疫突觸的形成來促進早期T細胞啟動。由于Treg細胞優(yōu)先表達NRP1，在沒有炎癥或外來抗原暴露的情況下，Treg細胞通過NRP1–NRP1相互作用使DC在免疫突觸上的作用時間更長，這是一種維持免疫耐受處于穩(wěn)態(tài)的機制。此外，在移植的情況下，細胞膜蛋白從APCs轉(zhuǎn)移到T細胞，稱為trogocytosis，通過幾種已知的NRP1配體（如Sema3A和VEGF）使CD4＋T細胞對抑制信號敏感。此外，VEGF作為一種免疫抑制細胞因子，可以以NRP1依賴的方式抑制脂多糖誘導(dǎo)的DC成熟。

總之，很明顯，NRP1介導(dǎo)重要的免疫調(diào)節(jié)功能，包括自我耐受和免疫穩(wěn)態(tài)，類似于一些已知的IRs的活性。然而，NRP1與經(jīng)典IRs的區(qū)別在于，它對多種細胞類型，特別是免疫抑制細胞產(chǎn)生這樣的影響。這些特征強調(diào)了為什么在癌癥的背景下檢查NRP1的功能可能是改進免疫治療的關(guān)鍵步驟。

NRP1在小鼠和人TME中的表達和功能

NRP1與癌癥之間已建立的聯(lián)系得到了三個關(guān)鍵的觀察結(jié)果的支持：（1）NRP1在多種人類癌癥類型的惡性細胞中高表達；（2）NRP1在TME中大量表達，包括基質(zhì)細胞和免疫細胞；（3）NRP1的表達通常與不良的臨床預(yù)后相關(guān)。從腫瘤細胞的角度來看，NRP1通過多種功能支持腫瘤細胞的生長，包括細胞存活、新生血管生成和轉(zhuǎn)移。

在腫瘤－免疫界面，NRP1通過在TME的免疫室中協(xié)調(diào)多種抑制過程來促進免疫逃避。一方面，NRP1在樹突狀細胞和巨噬細胞中的生理作用，有助于這些細胞的抗炎表型，被腫瘤“劫持”以促進腫瘤血管生成和腫瘤相關(guān)免疫抑制。另一方面，NRP1直接影響適應(yīng)性抗腫瘤免疫，這是通過調(diào)節(jié)腫瘤內(nèi)Treg細胞和CD8＋T細胞的細胞外和細胞內(nèi)抑制途徑來實現(xiàn)的。

Tregs細胞中的NRP1：穩(wěn)定性的守護者

NRP1在人體組織和免疫細胞亞群中的表達反映了在小鼠模型中的發(fā)現(xiàn)。最顯著的例外是Treg細胞。NRP1最初被認為是小鼠tTreg細胞的標記物，部分原因是它與Helios明顯共表達。事實上，小鼠Nrp1基因是Foxp3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的直接靶點，異位表達和染色質(zhì)免疫沉淀實驗證明了這一點。隨后的研究表明，NRP1在血液或淋巴結(jié)中的人類外周Treg細胞上不表達。相反，健康的供體Treg細胞在體外激活時上調(diào)NRP1，表明免疫過程可能在體內(nèi)調(diào)節(jié)了NRP1的表達。盡管NRP1調(diào)控可能具有物種特異性的決定因素，但下面討論的結(jié)果表明其對Treg細胞表型和功能的影響仍然是保守的。

在癌癥的情況下，NRP1的Treg細胞表達通過至少兩個平行的途徑增強免疫抑制：通過充當(dāng)VEGF的共受體促進Treg細胞向腫瘤募集，以及通過信號素－4A（Sema4a）維持腫瘤特異性Treg細胞的穩(wěn)定性。在Cd4CreNrp1L／L的NRP1敲除的小鼠腫瘤模型中，盡管大量Nrp1缺陷的Treg細胞在體外具有相同的抑制功能，但腫瘤內(nèi)CD8＋T細胞的比例和功能顯著增加。這導(dǎo)致在植入式和自發(fā)性腫瘤模型中提高了無瘤生存率并減緩腫瘤生長。由于NRP1在血管生成中起到VEGFR2共受體的作用，研究表明NRP1＋Treg細胞在體外沿著VEGF梯度遷移。此外，在野生型小鼠中，通過皮下注射Vegf–／–纖維肉瘤腫瘤，與Vegf＋的腫瘤相比，在野生型小鼠體內(nèi)腫瘤生長的減少可以重現(xiàn)。這些觀察結(jié)果強調(diào)了在腫瘤模型中，作為Treg細胞建立免疫抑制的關(guān)鍵成分，VEGF對Treg細胞的趨化反應(yīng)的重要性。

此外，除了細胞遷移外，NRP1對維持腫瘤內(nèi)Treg細胞功能和表型至關(guān)重要。通過抗體阻斷或Treg細胞特異性基因缺失（通過Foxp3CreNrp1L／L）破壞NRP1通路，阻礙了腫瘤內(nèi)Treg細胞抑制功能，從而恢復(fù)了抗腫瘤免疫，而避免了自身免疫的外周脫靶效應(yīng)。與Nrp1＋／＋野生型相比，Nrp1–／–腫瘤內(nèi)Treg細胞的Bcl2降低，活性caspase－3增加，表明生存路徑的失調(diào)。此外，Nrp1–／–瘤內(nèi)Treg細胞下調(diào)激活標記物（包括Helios、IL－10、ICOS、CD73）而出現(xiàn)特征性T輔助細胞系標記物（如Tbet、CXCR3、IRF－4和RORγT）。研究表明，NRP1定位于T細胞活化過程中的免疫突觸，通過磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）抑制Akt（又稱蛋白激酶B或PKB）活性，從而減輕Akt介導(dǎo)的對Foxo1／3的拮抗作用，穩(wěn)定Treg細胞功能。后續(xù)研究表明，雖然腫瘤內(nèi)Nrp1缺陷的Treg細胞保留了Foxp3的表達，但出現(xiàn)促炎性表型和IFN－γ的增加，表明其抑制功能的喪失。有趣的是，Nrp1–／–Treg細胞產(chǎn)生IFNγ會引起鄰近Nrp1＋Treg細胞功能紊亂。在MC38腫瘤模型中，為了調(diào)節(jié)抗PD1的免疫治療，需要Treg細胞增加對IFNγ的敏感性來達到腫瘤清除的目的。事實上，攜帶缺乏IFN－γ受體的Treg細胞的小鼠對抗PD1不敏感。這些發(fā)現(xiàn)為進一步研究NRP1作為治療藥物的拮抗作用提供了重要的臨床依據(jù)。

許多研究報告了癌癥患者的NRP1＋Treg細胞增多。這種Treg細胞表型在胰腺癌和結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的外周血中也有報道。在慢性淋巴細胞白血病中，在患者血液中觀察到B細胞和Treg細胞上NRP1升高，在沙利度胺治療后減少。還有報道稱，在宮頸癌患者的腫瘤引流淋巴結(jié)（TDLN）中，NRP1＋Treg細胞增多，尤其是腫瘤轉(zhuǎn)移的TDLN。此外，人NRP1＋Treg細胞的功能更為抑制，F(xiàn)OXP3和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNFR相關(guān)蛋白（GITR）在NRP1＋Treg細胞中的表達增加。有趣的是，針對VEGF結(jié)合域的NRP1拮抗劑通過誘導(dǎo)NRP1蛋白內(nèi)化，使人腫瘤內(nèi)Treg細胞抑制降低約20％。最后，還有研究報告了外周血中NRP1＋Treg細胞的升高，原發(fā)性黑色素瘤和頭頸部鱗狀細胞癌患者的腫瘤中NRP1＋Treg細胞的比率與無病生存率呈負相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)共同支持了NRP1＋Treg細胞在癌癥中功能增強的觀點。此外，在癌癥患者外周血中觀察到NRP1＋Treg細胞的增加。這一發(fā)現(xiàn)在IRs中是唯一的，它們在血液樣本中的表達往往很低，可能表明循環(huán)Treg細胞上的NRP1表達可作為臨床結(jié)果的預(yù)處理或治療預(yù)后生物標志物。