前言

嵌合抗原受體(CARs)T細胞進行過繼免疫治療是改善癌癥患者預(yù)后的一種非常有前景的方法。雖然CAR-T細胞血液系統(tǒng)惡性腫瘤很有效,但克服實體瘤依然困難重重,需要提高這種治療方法的療效。

目前,有幾種方法可以提高CAR-T細胞的抗腫瘤活性,包括靶向多種抗原;提高T細胞的增殖/持久性;增強腫瘤部位的歸巢以及使CAR-T細胞對免疫抑制腫瘤微環(huán)境(TME)產(chǎn)生抵抗。

通過轉(zhuǎn)基因表達細胞因子或工程化的細胞因子受體來增強T細胞活化的信號已成為一種很有前途的策略,因為它不僅能提高CAR-T細胞的擴增和持久性,而且還能增強它們在免疫抑制性TME中的功能。

CAR-T細胞的激活信號

CARs由四個組成部分組成:細胞外抗原識別結(jié)構(gòu)域,最常見的是單鏈可變片段(scFv);結(jié)構(gòu)成分,如鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域;提供維持CAR-T細胞效應(yīng)器功能的共刺激信號結(jié)構(gòu)域,以及CD3ζ 激活域。

生理性T細胞激活需要三種不同的信號來獲得效應(yīng)器功能和形成免疫記憶。

信號1(激活):T細胞受體(TCR)識別抗原后,通過CD3ζ介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

信號2(共刺激):來自CD28或其他分子的額外信號以增強信號1。

信號3由細胞因子介導(dǎo),促進原始T細胞增殖分化,從而轉(zhuǎn)化為效應(yīng)T細胞。

第一代CAR僅通過CD3ζ提供信號1,第二代CARs也提供了信號2,通常通過CD28或4-1BB共刺激。盡管活化的CAR-T細胞能夠產(chǎn)生細胞因子,如IL-2,但反復(fù)暴露于腫瘤細胞后,細胞因子的產(chǎn)生會減少。另外,一些對T細胞效應(yīng)器功能很重要的細胞因子,如IL-12和IL-15,要么表達水平低,要么根本不是由T細胞產(chǎn)生的。

由于這些局限性,研究人員開始著眼于進一步增強CAR-T細胞,通過組成性和誘導(dǎo)性表達細胞因子或者工程化細胞因子受體來增強信號3。

常見的γ鏈細胞因子及其受體

細胞因子的γ鏈共受體家族包括IL-2,IL-4,IL-7,IL-9,IL-15和IL-21,它們在T細胞分化,增殖和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用。這些細胞因子的受體包括共同的γ鏈(γc) 和一個各自單獨的受體鏈,但IL-2和IL-15共享IL-2Rβ。這些細胞因子受體下游信號激活STAT家族的成員。

IL-4和IL-9

到目前為止,IL-4和IL-9在過繼性細胞治療中的作用尚不清楚。IL-4雖然也有抗癌特性,但更多發(fā)揮的是免疫抑制作用。

IL-9最初被描述為一種參與Th2應(yīng)答的T細胞生長因子,雖然很少有文獻評價IL-9在改善CAR-T細胞治療中的效用,但最近發(fā)現(xiàn)Th9/Tc9極化的人類CAR-T細胞與傳統(tǒng)的Th1/Tc1 CAR-T細胞相比具有更好的抗腫瘤活性。然而,關(guān)于IL-9在抗腫瘤反應(yīng)中的作用存在相互矛盾的證據(jù),需要進一步的工作來評估。

IL-2和IL-15

IL-2和IL-15促進免疫細胞增殖和抗凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄,但自然殺傷(NK)細胞和T細胞亞群對這兩種細胞因子的反應(yīng)不同。高親和力IL-2受體由調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)和活化的CD4、CD8+T細胞表達,而CD8+記憶T細胞和NK細胞對IL-2的反應(yīng)程度較低。相反,CD8+記憶T細胞和NK細胞對IL-15的反應(yīng)最為敏感,而Tregs對IL-15不反應(yīng)。

與單獨治療相比,第1代CD19-CAR-T細胞通過結(jié)構(gòu)性表達IL-2能提高播散性淋巴瘤小鼠的無瘤生存率。然而,由于IL-2對Treg細胞的潛在擴增會阻礙抗腫瘤反應(yīng)。此外,長期暴露于IL-2可促進激活誘導(dǎo)的細胞死亡(AICD),并且使T細胞向高細胞毒性的終末效應(yīng)細胞分化,這些效應(yīng)細胞雖然可有效殺死腫瘤細胞,但無法長久維持。

在靶向包括CD19、GPC-3、CLL-1、GD2和IL-13Rα2的CAR-T細胞中結(jié)構(gòu)性表達IL-15均顯著提高了CAR-T細胞的抗腫瘤活性。IL-15對記憶T細胞亞群如干細胞記憶T細胞(Tscm)的擴增或維持可能有助于增強CAR-T細胞作用的持久性。

第一代CD19-CAR-T細胞表達IL-15提高了其體內(nèi)抗腫瘤活性,并允許細胞在小鼠體內(nèi)存活長達110天。除了分泌性IL-15外,表達膜結(jié)合形式的IL-15是向CAR-T細胞提供激活信號的另一種方式。這種方法目前正在CD19-CAR-T細胞的1期試驗中進行評估。

除了CAR-T細胞外,CAR-natural killer T(NKT)細胞也被基因修飾以表達IL-15。IL15-NKT細胞維持了一個中樞記憶樣細胞群,這些細胞不太容易衰竭和凋亡,從而提高抗腫瘤活性。此外,IL-15保護CAR-NKT細胞免受缺氧TME的抑制。基于這些研究,目前正在評估共表達IL-15的GD2-CAR NKT細胞在神經(jīng)母細胞瘤患兒中的安全性和有效性。

IL-7

皮下注射IL-7可誘導(dǎo)循環(huán)中CD4和CD8+T細胞數(shù)量的劑量依賴性增加,而不會引起嚴重的不良事件。因此,IL-7的轉(zhuǎn)基因表達已被探索作為激活CAR-T細胞的替代方法。與表達IL-2或IL-15的CAR-T細胞相比,IL-7的結(jié)構(gòu)性表達提高了CD19-CAR-T細胞的抗腫瘤活性,這可能是持續(xù)的靶細胞殺傷和T細胞擴增的結(jié)果,但是這些細胞沒有表現(xiàn)出在表達IL-15的CD19-CAR-T細胞上觀察到的長期持久性。

IL-7同樣改善了CD20-和mesothelin-CAR T細胞,但這種作用需要C-C基序趨化因子配體19(CCL19)的共同表達。IL-7和CCL19的表達增加了CAR-T細胞、內(nèi)源性T細胞和樹突狀細胞的腫瘤內(nèi)浸潤,因而具有更好的抗腫瘤活性。目前,已有多項研究進入臨床階段,以評估IL-7和CCL19表達的CAR-T細胞對淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤和實體瘤的安全性和有效性。

IL-21

與其他γc細胞因子激活STAT5相比,IL-21更傾向于激活STAT3,同時也通過PI3K和MAPK途徑介導(dǎo)增殖。第一代CD19-CAR-T細胞結(jié)構(gòu)性表達IL-21提高了播散性淋巴瘤小鼠的整體存活率。與表達IL-2、IL-7或IL-15的CAR-T細胞相比,表達IL-21的CAR-T細胞的總存活率提高最大,盡管這些細胞表達較低水平的Bcl-2、IFN-γ, TNF-α。抗腫瘤活性的提高可能是由于維持低分化效應(yīng)記憶T細胞(TEM)亞群,以及增強了長期持久性。目前,IL-21驅(qū)動的STAT3信號在CAR-T細胞免疫治療中的療效仍在探索中。

組成性活性細胞因子受體

增強T細胞活化信號3的另一種策略是通過工程化細胞因子受體的轉(zhuǎn)基因表達。例如, IL-7組成性活性受體(C7R)的表達可以克服由于負反饋機制引起的IL-7Rα下調(diào),在不需要IL-7的情況下提供持續(xù)的STAT5信號。C7R介導(dǎo)增強的STAT5信號以抗原依賴的方式提高GD2-和EphA2-CAR-T細胞的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性。評估表達C7R的GD2-CAR-T細胞的臨床試驗正在進行中。

表達IL-7Rα串聯(lián)IL-7是提供細胞內(nèi)IL-7信號的另一種方式。此外,通過表達嵌合的IL-7Rα串聯(lián)IL-17以及IL-2Rβ受體可以在CAR-T細胞中提供額外的信號,研究證明這些工程化的CAR-T細胞對TGF-β的抑制具有抗性。

嵌合細胞因子受體

嵌合細胞因子受體或開關(guān)受體可將一種細胞因子信號轉(zhuǎn)換為另一種細胞因子信號,目前正在積極探索如何劫持腫瘤或腫瘤相關(guān)細胞產(chǎn)生的免疫抑制細胞因子,以向CAR-T細胞提供增殖信號。

結(jié)合IL-4但激活I(lǐng)L-7信號通路的IL-4/IL-7開關(guān)受體可以使PSCA-CAR-T細胞在體外維持其細胞溶解和增殖能力,并提高體內(nèi)抗腫瘤活性。在原位乳腺癌模型中,IL-4/IL-7開關(guān)受體也提高了第二代MUC1-CAR-T細胞的抗腫瘤活性。重要的是,這些細胞能夠通過IL-4依賴性的方式增殖和消除腫瘤細胞,并對遠端的腫瘤再生作出反應(yīng)。

此外,在MUC1或PSMA-CAR-T細胞中表達IL-4/IL-2開關(guān)受體,通過增加IL-4存在下的STAT5和ERK磷酸化,提高其細胞溶解活性和增殖能力。目前,表達IL-4/IL-2開關(guān)受體的CAR-T細胞治療頭頸部鱗狀細胞癌的1期臨床試驗正在進行中。

IL-4/IL-21開關(guān)受體被設(shè)計成將STAT6轉(zhuǎn)換成STAT3信號。這種開關(guān)受體在IL-4存在下提高了GPC3-CAR-T細胞的細胞溶解活性。很少有研究直接比較不同的細胞因子開關(guān)受體,然而,比較GPC3-CAR-T細胞中的IL-4/IL-7和IL-4/IL-21開關(guān)受體表明,在一種實體瘤模型中,IL-4/IL-21開關(guān)受體更為優(yōu)越。

IL-12家族細胞因子及其受體

IL-12細胞因子家族包括IL-12、IL-23、IL-27和IL-35,它們在先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中具有不同的作用,其中IL-12和IL-23具有促炎作用,IL-27具有促炎和抗炎作用,IL-35具有抗炎作用。由于IL-27和IL-35的主要抗炎作用,在過繼性細胞治療中,只有IL-12和IL-23有所研究。

IL-12

IL-12作為單藥,在臨床前模型中,系統(tǒng)給藥產(chǎn)生了強大的抗腫瘤活性。然而,重組人IL-12的臨床試驗療效有限,并且收到毒性的限制。盡管如此,表達IL-12的CAR-T細胞的仍在積極探索中。

MUC16ecto-CAR-T細胞表達IL-12增強了IFN-γ的表達和持久性,提高了原位異種移植模型的存活率。研究表明,CAR-T細胞通過自分泌IL-12信號增強效應(yīng)器功能,與腫瘤相關(guān)免疫細胞相互作用,耗竭免疫抑制髓系細胞,阻斷腫瘤的PD-L1抑制。表達IL-12的MUC16ecto-CAR-T細胞的臨床研究正在進行中。

此外,工程化T細胞組成性表達IL-12可能促進T細胞功能障礙,并且在臨床前模型中觀察到毒性,因此設(shè)計了受活化T細胞核因子(NFAT)啟動子控制的IL-12表達。NFAT啟動子將IL-12表達與T細胞活化聯(lián)系起來,在不降低抗腫瘤活性的情況下降低全身毒性。NFAT誘導(dǎo)的IL-12表達的CAR-T細胞在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的I/II期臨床試驗正在進行中。

IL-23

雖然很少有研究將IL-23與細胞治療相結(jié)合,但最近的研究表明,這可能是改善實體瘤中CAR-T細胞功能的一種選擇。IL-23誘導(dǎo)STAT3激活,而CAR-T細胞中的STAT3信號與慢性淋巴細胞白血病患者的響應(yīng)相關(guān)。目前,STAT3信號的調(diào)節(jié)已用于改善其他臨床前模型中的CAR-T細胞。

IL-1超家族細胞因子

IL-1超家族細胞因子包括IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-1Ra、IL-18、IL-37、IL-36Ra、IL-36α、IL-36β、IL-36γ和IL-38,它們在先天性和適應(yīng)性免疫中起著重要作用。但在臨床前和臨床試驗中,這些細胞因子中只有一部分被認為為能夠誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

IL-18

IL-18是由巨噬細胞、樹突狀細胞、上皮細胞以及其他細胞類型產(chǎn)生的一種促炎癥細胞因子,與NK細胞和抗原相關(guān)T細胞上表達的由IL-18Rα和IL-18Rβ組成的異二聚體受體相互作用。IL-18通過MyD88和NF-kB發(fā)出信號,并已被證明具有促腫瘤功能,如促進血管生成、轉(zhuǎn)移和增殖,但由于其在Th1反應(yīng)中的協(xié)同作用,被認為在更大程度上具有抗腫瘤活性。

將人類和小鼠的CAR-T細胞中表達IL-18,可以改善CAR/TCR介導(dǎo)的增殖、細胞因子的產(chǎn)生和抗腫瘤活性。一項研究表明在CD4-CAR-T細胞中表達IL-18促進了CD8-CAR-T細胞的擴增。

IL-36

IL-36α, IL-36β, 和IL-36γ 是新發(fā)現(xiàn)的IL-1超家族成員,在臨床前模型中顯示出強大的抗腫瘤活性。這些細胞因子共享一個由IL-36R和IL-1RAcP組成的異二聚體受體,通過MyD88和NF-kB激活下游信號。研究表明,工程化CAR-T細胞表達IL-36γ 與未修飾的CAR-T細胞相比,提高了增殖和持久性,從而提高了抗腫瘤活性。

小結(jié)

研究表明,轉(zhuǎn)基因細胞因子不僅能增強CAR-T細胞的抗腫瘤活性,而且能調(diào)節(jié)TME內(nèi)的其他細胞,并能誘導(dǎo)或增強內(nèi)源性腫瘤特異性免疫反應(yīng)。然而,增強CAR-T細胞功能的繼發(fā)性基因修飾可能加重CRS,因此改善CAR-T細胞擴增的方法必須與劑量限制性毒性的風(fēng)險相權(quán)衡。

到目前為止,大多數(shù)研究只探討了單個細胞因子的組成性表達。在CAR-T細胞活化的不同階段,開發(fā)能使CAR-T細胞表達一系列細胞因子的方法,不僅可以提高療效,而且可以提高安全性。隨著這些方法的發(fā)展,相信未來細胞因子將為CAR-T細胞克服實體瘤提供更加強大的助力。

參考文獻:

1． Engineered Cytokine Signaling to Improve CAR T CellEffector Function． Front Immunol． 2021; 12: 684642．