前言

T細胞過繼療法目前已成為一種公認的抗癌免疫療法,尤其在血液腫瘤表現(xiàn)出卓越的治療潛力。通過設計嵌合抗原受體(CAR)或αβ-T細胞受體(TCR)轉基因,編碼到載體(如慢病毒)中,用于T細胞的轉導。2017年,美國食品藥物監(jiān)督管理局(FDA)首次批準了兩種CAR-T療法,即tisagenlecleucel(Kymriah?)和Axicabatagene ciloleucel(Yescarta?),分別用于治療急性淋巴細胞白血病和彌漫性大B細胞淋巴瘤。到目前為止,已有5種CAR-T療法得到了批準。

CAR-T/TCR-T細胞制造的關鍵步驟包括:采集患者外周血單個核細胞(PBMC)、用抗CD3/抗CD28抗體富集T細胞、病毒介導的體外轉導和擴增、冷凍保存和運輸以及制劑和劑量的考慮。這五個屬性將包括在藥品開發(fā)質量指南Q8(R2)中提到的質量目標產(chǎn)品簡介(QTPP)中,隨著臨床醫(yī)生對癌癥治療方案的日益了解,這五個屬性可能在I期和III期臨床試驗之間發(fā)生變化。

隨著越來越多的CAR-T細胞療法的市場批準,可以對其制劑設計和給藥方式進行比較。這些數(shù)據(jù)有助于指導未來更多自體T細胞藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)和性能優(yōu)化。

T細胞劑量

向患者輸注后,CAR-T細胞在體內(nèi)繼續(xù)增殖,并在一些患者體內(nèi)持續(xù)存在4年,與持續(xù)功能性的治療效果相關。市場上銷售的CAR-T細胞療法的藥代動力學曲線通常顯示1-2周時的峰值水平(Tmax),總藥物暴露量(AUC0-28d)和最大峰值濃度(Cmax)。CAR-T細胞劑量優(yōu)化的第一階段臨床試驗設計仍然是一個有爭議的話題,但通常涉及3+3劑量遞增的變化,例如,在抗CD19 CAR-T細胞的I期研究中,10名復發(fā)/難治性B細胞非霍奇金淋巴瘤患者接受了2．5×107(n=3)、5×107(n=4)和1×108(n=3)CAR-T細胞的遞增劑量。下表顯示了五種FDA批準的CAR-T細胞療法的劑量、主要容器和填充體積。

TCR-T細胞治療可能需要填充幾個袋子,因為劑量(細胞數(shù)量)至少要大一個數(shù)量級。例如,在深圳第二人民醫(yī)院最近進行的一項臨床試驗中,四名非小細胞肺癌患者接受NY-ESO-1的TCR-T細胞劑量范圍為1．67-10．60×109(中位數(shù)為7．16×109細胞,轉導效率36．6-96．6%),靜脈輸注1-3天。通過對上述劑量、填充量和主要容器的粗略比較,很明顯,制劑在滿足QTPP的制劑設計方面的選擇相對有限,即冷凍袋/小瓶中的冷凍保存,靜脈輸液T細胞濃度范圍為106–108 /mL。

生產(chǎn)自動化

從癌癥患者獲得的PBMC的質量和數(shù)量將受到疾病進展、免疫功能和暴露于導致淋巴細胞減少的化療藥物的影響,它們的特性將反過來影響T細胞的轉導效率、增殖、表型(效應/記憶、CD4+/CD8+比率等)以及最終可制造的劑量。因此,自體T細胞的常規(guī)制造仍然非常具有挑戰(zhàn)性。

上述的關鍵制造步驟需要復雜而漫長的工作流程,以天到周為單位。簡化T細胞制造過程是降低T細胞療法商品成本(COG)的重要策略。這推動了制劑和填充-完成步驟朝著全自動或半自動方向的發(fā)展。

根據(jù)良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP),在ISO14644-1 7級潔凈室(相當于FDA 10000級和歐盟C級)運行的無菌產(chǎn)品的封閉端到端工作流程明顯優(yōu)于ISO 14644-1 5級潔凈室中需要密集手動步驟的開放流程(相當于FDA 100級,約等于歐盟A級)。更先進的培養(yǎng)設備實現(xiàn)了完全封閉、自動化的端到端過程,這已在美國國立衛(wèi)生研究院臨床中心得到實現(xiàn),該中心為I/II期臨床試驗提供TCR-T細胞。一份報告顯示擴增10天后,獲得2．9(±0．7)×109個T細胞(含CAR轉基因慢病毒的轉導效率為55%,存活率為96．5%,CD3+T細胞為98%)。

在擴增并對原藥中的有核細胞(TNC)總數(shù)進行計數(shù)之后,制劑步驟涉及細胞濃縮/洗滌和再懸浮/稀釋到含有二甲基亞砜(DMSO)的最終緩沖液中,使其達到藥品的目標TNC濃度。在手動過程中,目標TNC/mL值可以通過必要的再懸浮/稀釋步驟很容易達到。而在一個封閉的自動填充-完成過程中,需要通過原藥的TNC/mL值計算細胞濃度和稀釋步驟,以滿足藥物產(chǎn)品的目標TNC/mL。去除掉用于質控的藥品外,其余藥物按填充袋的參考有效填充體積分裝。通過轉導效率計算CAR/TCR陽性T細胞的數(shù)量,該值應符合治療劑量,并在藥品標簽上列出。T細胞藥品需要滿足放行規(guī)格,如下表所列。

填充-完成

蠕動泵在硅膠管的支撐段內(nèi)產(chǎn)生流動,該硅膠管是一次性使用裝置(SUS)的一部分,是維持封閉端到端T細胞過程的方便解決方案。所有管道、過濾器、接頭和袋子都經(jīng)過預消毒,封閉式灌裝-精加工工作流程可確保ISO 14644-1 7級(最低)潔凈室中的產(chǎn)品質量。

蠕動泵在硅管中產(chǎn)生精確、無脈動的流動,可將大體積范圍的藥物產(chǎn)品裝入不同大小和數(shù)量的袋子中�？赡軐⒖諝鈴拇篌w積袋帶入藥品袋仍然是一個問題,可以考慮監(jiān)測袋重。緩沖成分的混合效率需要注意,因為輔料濃度必須保持在藥物開發(fā)研究期間規(guī)定的配方設計空間內(nèi)。DMSO的濃度可以通過比較制劑步驟前后和解凍后的滲透壓和T細胞質量/數(shù)量來確定。

主容器選擇

主容器是與藥品直接接觸的容器,對于目前上市的CAR-T產(chǎn)品,主容器是能夠承受低溫儲存的袋子或小瓶。目前的首選似乎是乙烯-醋酸乙烯酯(EVA)或聚烯烴袋,其中有多家制造商。這與聚氯乙烯(PVC)作為血液制品(如紅細胞)低溫袋材料的長期使用不同,常用的PVC增塑劑是鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)。DEHP已被證明是有爭議的,因為它會滲入血液制品中,盡管它的存在會穩(wěn)定紅細胞膜,但它是一種已知的致癌物和內(nèi)分泌干擾物,對人類和環(huán)境都有影響。長期提取增塑劑也會降低PVC的柔韌性,因此,PVC不適合作為T細胞的主容器材料。

EVA可滲透氣態(tài)CO2和O2,這是在T細胞填充-完成步驟和給藥之間維持細胞代謝和活力所必需的。對于水蒸氣,滲透系數(shù)分別比CO2和O2大3到4個數(shù)量級。相比之下,PVC和PE對水蒸氣、CO2和O2的滲透性較低。

主容器必須足夠堅固,能夠承受運輸條件下的低溫,以及解凍至環(huán)境溫度。雖然文獻中不經(jīng)常報告,但袋故障確實會發(fā)生。Mele等人報告了377袋外周血祖細胞(PBPC)的破裂率為1．06%(4袋)。在四個袋子中,三個在從液氮罐中取出的過程中破裂,一個由于意外損壞。Khuu等人記錄了體積為25–75 mL PBPC或淋巴細胞藥物產(chǎn)品的EVA袋故障率, 2000-2002年三年的故障率分別為1．7%(10/599)、9．6%(58/605)和0%(0/177)。高故障率歸因于來自一個供應商的特定袋批次,而不是產(chǎn)品類型、配方、儲存或冷凍所致。

顆粒物、可提取物和可浸出物

通過采用SUS進行T細胞處理,消除了工藝轉換和清潔/蒸汽產(chǎn)生的潛在污染,但SUS材料必須具有更好的性能、純度,并且實際上不含微粒�？商崛∥锸侵冈跇O端條件下從SUS中釋放出來的化學物質,包括在藥品保質期內(nèi)遷移出去的可浸出物。

顆粒物同樣受到監(jiān)管機構的控制,因為如果注入,它們有可能阻塞血管并損害組織/器官,具體取決于其大小、形狀、成分和數(shù)量。盡管SUS是在潔凈室中生產(chǎn)的,但不能排除在藥品填充過程中微粒粘附在塑料薄膜上并隨后被帶入主容器的可能性。美國材料與試驗協(xié)會(American Society for Testing and Materials)提出了與用水或水加鹽沖洗SUS表面顆粒以生成定量分析懸浮液相關的行業(yè)標準化方法。

細胞藥物產(chǎn)品的凍融

冷凍速率是在給定DMSO濃度下控制冰核形成和生長的方法。然而,。目前尚未就T細胞藥物產(chǎn)品的首選冷凍模式達成共識,運輸或儲存期間降低溫度漂移風險需要逐案評估。弗勞恩霍夫研究所(IBMT)開發(fā)了一種新型機器人系統(tǒng),能夠在“IBMT培養(yǎng)基I”(10% DMSO和1% Poloxamer18)中精確地循環(huán)冷凍PBMC的溫度,濃度為107個細胞/ml。在-135°C和-60°C兩個溫度循環(huán)之間循環(huán)400次,保持了更高的PBMC活力和抗原特異性T細胞反應。

T細胞產(chǎn)品完全解凍后應立即輸注,無需進一步稀釋。這就提出了如何最好地繼續(xù)解凍步驟的問題,因為存在多個選項。理論上,應避免緩慢解凍,以防止去玻璃化,即加熱速率低于臨界升溫速率時,無定形冰內(nèi)形成冰晶。此外,必須確保加熱的均勻性,以防止熱應變導致物理應力。

DMSO對細胞的物理效應

DMSO是一種高效的細胞冷凍保護劑,但具有細胞毒性作用,因此需要從分子水平了解其對脂膜和細胞內(nèi)大分子的作用。DMSO分子與二棕櫚酰磷脂酰膽堿相互作用的分子動力學模擬表明,DMSO插入脂質頭基團下方,破壞脂質-脂質排列,降低雙層剛性,促進膜融合。因此,在冷凍和/或解凍過程中,細胞器和細胞膜的結構變形可以更容易適應,這是DMSO低溫保護作用的一個關鍵機制。

DMSO對T細胞制劑具有較高的滲透壓:即使是低濃度5%v/v的DMSO也相當于704mOsmol/kg,這明顯高于血液。因此,T細胞制劑滲透壓的測量應在藥品更廣泛的分析特性范圍內(nèi)。

新型賦形劑和T細胞制劑

DMSO具有潛在毒性,因此基于對DMSO使用的擔憂,人們在積極地尋找替代性低溫保存劑。許多研究小組已經(jīng)開發(fā)了多種賦形劑的組合,其中一些單獨用于上市藥物,特別是與T細胞冷凍保存相關的賦形劑組合。

用于細胞冷凍保存的商用無DMSO培養(yǎng)基的數(shù)量驚人地多,雖然大多數(shù)是無血清的,或化學級別的,但很少有“GMP級”,并且?guī)缀鯖]有可以應用于T細胞系的證據(jù)。一個例外是Stem CellBanker?,它用丙二醇(10%)代替DMSO,已經(jīng)用Jurkat細胞系進行了測試,并具有公認的FDA文件。然而,用丙二醇或甘油替代DMSO并不能緩解高滲壓或體內(nèi)毒性的擔憂。EMA發(fā)布了一份關于丙二醇作為靜脈給藥輔料的文件,包括兒童和成人的耐受性和建議限值。

小結

目前,全球多達上千項關于CAR-T或TCR-T細胞療法處于臨床開發(fā)階段,CAR-T細胞的產(chǎn)品質量也更多的受到人們的關注。從制劑的角度來看,未來需要解決的目標包括更大范圍的細胞劑量和濃度、更優(yōu)的主容器和不同T細胞表型的共同制劑。為了支持這些目標,有必要推進冷凍保存的研究,以便降低滲透壓、細胞毒性和非水溶劑暴露時間,同時提高對不同冷凍速率的耐受性。塑料性能的進步將提高容器在超低溫下的堅固性,新的焊接/密封工藝將提高SUS設計和組裝的靈活性。

FDA最近表示,“到2025年,我們預計FDA將每年批準10到20種細胞和基因治療產(chǎn)品”,并將“最大限度地利用我們的加速項目,包括再生醫(yī)學高級治療(RMAT)的指定和加速批準”。根據(jù)目前的批準,自體T細胞免疫療法將是這些細胞和基因治療產(chǎn)品的主要部分,并且制劑設計將在確保它們到達患者體內(nèi)方面起著關鍵作用。

參考文獻:

1．Formulation Considerations for Autologous TCell Drug Products． Pharmaceutics． 2021 Aug; 13(8): 1317．