近年來,生物藥的市場需求逐年擴(kuò)容,其中抗體藥物因其靶向性好,治療效果顯著,在生物藥中占據(jù)著舉足輕重的地位,目前已經(jīng)進(jìn)入了抗體藥物發(fā)展的黃金時代。隨著抗體藥的需求越來越大,抗體篩選技術(shù)的發(fā)展也是日新月異,目前應(yīng)用較普遍的有雜交瘤技術(shù)、抗體文庫篩選技術(shù)、B細(xì)胞克隆技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠抗體篩選技術(shù)。雜交瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù)又稱為單克隆抗體技術(shù),是在體細(xì)胞融合的技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。這項(xiàng)技術(shù)將免疫動物的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合,即可形成在體外長期存活并分泌免疫蛋白的雜交瘤細(xì)胞,通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細(xì)胞的單克隆系,即雜交瘤細(xì)胞系,利用雜交瘤細(xì)胞可以大量的生產(chǎn)單克隆抗體。                          

1975年,Kohler和Milstein在劍橋大學(xué)醫(yī)學(xué)委員會分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,成功把免疫小鼠的脾臟B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合,形成了B細(xì)胞-骨髓瘤雜合體。這種細(xì)胞雜合體既能在體外培養(yǎng)中無限地快速增殖且存活,又能分泌抗羊紅細(xì)胞的單克隆抗體。同年8月7日,Kohler和Milstein在英國《自然》雜志上發(fā)表了題為(Continuous culturesoff  used cells secreting antibody of predefined specificity)的著名論文,正式提出了雜交瘤這一概念。1984年,因其對免疫學(xué)做出的貢獻(xiàn),他們與Niels K． Jerne共同榮獲諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。

細(xì)胞融合技術(shù)是雜交瘤技術(shù)的基礎(chǔ),通過聚乙二醇(PEG)(最常用)、仙臺病毒、電轉(zhuǎn)等方法對細(xì)胞進(jìn)行人工誘導(dǎo),可使兩個細(xì)胞通過膜融合形成單個細(xì)胞。融合細(xì)胞的篩選 HAT培養(yǎng)基篩選技術(shù)是雜交瘤技術(shù)中另一個關(guān)鍵的技術(shù),在B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后,會產(chǎn)生多種融合結(jié)果(未融合的骨髓瘤細(xì)胞、未融合的B淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞自身融合細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞自身融合細(xì)胞、正確融合的雜交瘤細(xì)胞),為了得到所需的雜交瘤細(xì)胞,必須利用 HAT 培養(yǎng)基對融合后的細(xì)胞進(jìn)行篩選。HAT培養(yǎng)基的篩選原理為:DNA合成途徑有生物合成途徑與應(yīng)急合成途徑兩種,HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷酸(T)等物質(zhì),氨基喋呤可以對 DNA的生物合成途徑進(jìn)行阻斷,骨髓瘤細(xì)胞會因?yàn)樯�物合成途徑被阻斷且自身缺乏�?yīng)急合成途徑導(dǎo)致不能增殖進(jìn)而快速的死亡;而B淋巴細(xì)胞因缺乏體外增殖的能力,一般在10天左右死亡;雜交瘤細(xì)胞具有體外增殖能力且由于次黃嘌呤與胸腺嘧啶核苷酸的存在,可以通過應(yīng)急途徑合成DNA并在 HAT培養(yǎng)基中正常生長,不會死亡。因此將融合后的細(xì)胞放于 HAT 培養(yǎng)基中培養(yǎng),其他的融合結(jié)果會全部死亡,最終篩選出雜交瘤細(xì)胞。噬菌體展示技術(shù)1985年Smith GP利用基因工程,將外源基因插入絲狀噬菌體(Filamentous bacteriophage,fd)的基因組,使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示,從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術(shù)。其因在噬菌體展示相關(guān)研究方面的貢獻(xiàn)在2018年獲得了諾貝爾化學(xué)獎。1990年,Mc Cafferty等利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了庫容為106的抗體庫,使其成為一種新興的抗體制備技術(shù)。而SirGregory P． Winter是第一個利用噬菌體展示技術(shù)將鼠源抗體藥物人源化,使得抗體藥物用于臨床治療,比如Adalimumab。噬菌體展示技術(shù)(phage display)是將外源編碼多肽或蛋白質(zhì)的基因通過基因工程技術(shù)插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置,在閱讀框能正確表達(dá),使外源多肽或蛋白在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白,隨子代噬菌體的重新組裝呈現(xiàn)在噬菌體表面,可以保持相對的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。然后利用靶分子,采用合適的淘洗方法,洗去未特異性結(jié)合的噬菌體。再用酸堿或者競爭的分子洗脫下結(jié)合的噬菌體,中和后的噬菌體感染大腸桿菌擴(kuò)增,經(jīng)過3-5輪的富集,逐步提高可以特異性識別靶分子的噬菌體比例,最終獲得識別靶分子的多肽或者蛋白。

除了噬菌體展示技術(shù)之外,基于文庫展示的技術(shù)還包括:酵母展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)以及細(xì)胞展示技術(shù)等。B細(xì)胞克隆技術(shù)通過經(jīng)典免疫學(xué)的研究,我們已經(jīng)了解,人和動物接受了外源性免疫原(如細(xì)菌、病毒、非同源蛋白等)的刺激后,獲得性免疫(Adaptive Immunity)被激活,并在 T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的協(xié)同作用下,由 B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生針對于該病原體(或免疫原)的抗體分子;B 淋巴細(xì)胞經(jīng)過一系列的成熟和分化之后,最終形成漿細(xì)胞(Plasma cell)將大量的 IgG 分泌到血液等循環(huán)系統(tǒng)中;而特定的某一個 B 淋巴細(xì)胞在經(jīng)歷了 V-D-J 重排、Class Switch 和 Somatic maturation 之后,只含有一對編碼 IgG 重鏈和輕鏈的基因。因此,經(jīng)過 B 淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記物和抗原特異性篩選,可以獲得針對特異性抗原的單個 B 淋巴細(xì)胞,然后通過分子生物學(xué)手段從中獲得編碼抗體 IgG 的重鏈和輕鏈基因,并在體外重組表達(dá)驗(yàn)證,是目前獲得單克隆抗體最有效和快速的技術(shù)�；�于單 B 細(xì)胞篩選的抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)發(fā)展,還得益于流式細(xì)胞技術(shù)、微流控技術(shù)(Microfluidic)以及光流體技術(shù)(Optofluidic)等相關(guān)生物技術(shù)的發(fā)展和成熟,使其成功的從實(shí)驗(yàn)室走向商業(yè)化應(yīng)用,并在單克隆抗體特別是治療性單克隆抗體的開發(fā)方面被廣泛應(yīng)用。

基于單 B 細(xì)胞分選技術(shù)的單克隆抗體開發(fā)平臺,和傳統(tǒng)的單克隆抗體開發(fā)平臺相比,最突出的優(yōu)勢在于能夠從人體內(nèi)直接篩選獲得全人源單克隆抗體;同時,也能夠大大縮短研發(fā)周期,從獲得康復(fù)病人的外周血淋巴細(xì)胞開始,一般來說在 4-6 周內(nèi)即可獲得全人源單克隆抗體,并完成相應(yīng)的生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)(如病毒結(jié)合和中和實(shí)驗(yàn)、ADCC 實(shí)驗(yàn)等);并且由于所獲得是全人源單克隆抗體,可以大大簡化甚至于不需要抗體人源化改造工程,快速推進(jìn)至臨床試驗(yàn)。　　

轉(zhuǎn)基因小鼠全人源抗體篩選技術(shù)早在1985年,Alt等人就曾提出可以應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到具有人源序列的單克隆抗體。1989年,Bruggemann等人在小鼠中表達(dá)了人源重鏈,從而產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因編碼的免疫應(yīng)答。而在1994年,Lonberg和Jakobovits的團(tuán)隊分別采用了不同的方法構(gòu)建了能夠表達(dá)人源抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。Lonberg利用了核內(nèi)顯微注射的方法,而Jakovovits用的是酵母人工染色體(YAC)的方法。重鏈包含3個重鏈可變區(qū)(VH),16個D,所有的6個JH區(qū)。Abgenix的XenoMouse?是第一個同時有大部分人源VH和人源Vκrepertoire的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。這些XenoMouse?小鼠有百萬堿基對大小的酵母人工染色體,在重鏈基因座,有34個有功能的VH基因,全部的DH和JH區(qū)域,作為Cμ和Cδ功能下游的人源Cγ2基因;κ輕鏈基因座含有18個Vκ基因,全部五個功能性的Jκ區(qū),和Cκ基因。由于YAC可以整合到小鼠染色體中,這樣得到的小鼠具有較好的基因穩(wěn)定性。2005年,安進(jìn)以22億美元收購Abgenix。XenoMouse平臺上開發(fā)出的第一個單抗藥物是Abgenix和安進(jìn)共同開發(fā)的抗EGFR單抗panitumumab(于2006．9被FDA批準(zhǔn)),這也是基于轉(zhuǎn)基因小鼠的第一個全人源單抗藥物。

另一個用于產(chǎn)生全人源抗體的小鼠是GenPharmInternational, Inc開發(fā)的HuMab?或者叫Ultimab?。1997年,Medarex收購了該公司獲得這一技術(shù)平臺。2009年,BMS以24億美元收購Medarex,將Humab小鼠收入囊中。這一平臺可產(chǎn)生高親和力(納摩到亞納摩級別)的人源抗體。

Ofatumumab是基于Ultimab平臺開發(fā)出的抗CD20單抗,它和同為CD20抗體的rituximab靶向的表位不同。Ofatumumab于2009年十月被FDA批準(zhǔn)用于治療慢性淋巴細(xì)胞白血病。Ultimab平臺還有一系列諸如Canakinumab(抗interleukin-1β的IgG1單抗,用于治療一種罕見的自身炎癥性疾病Cryopyrin蛋白相關(guān)周期性綜合征), Ustekinumab(靶向IL-12和IL-23所共有的p40亞單位,用于18歲及以上活動性銀屑病關(guān)節(jié)炎患者的治療)等單抗產(chǎn)生。