前言

基于T細胞的免疫療法的出現(xiàn)顯著改變了癌癥患者的治療模式。盡管取得了成功,但目前批準的免疫治療方案仍然存在局限性。因此,需要對T細胞活化和抑制的分子機制有更深入的了解,以合理地擴大改善免疫治療的靶點和可能性。

免疫信號通路下游的蛋白質(zhì)泛素化對于幾乎所有免疫反應(yīng),特別是T細胞激活的正調(diào)節(jié)和負調(diào)節(jié)至關(guān)重要。大量研究表明,泛素化通過控制蛋白質(zhì)的功能、定位和穩(wěn)定性發(fā)揮多種細胞和分子作用,對泛素依賴性通路的調(diào)節(jié)可以顯著改變T細胞的活化并增強抗腫瘤反應(yīng)。因此,人們正在積極開發(fā)有選擇性地利用泛素相關(guān)酶用于癌癥治療的技術(shù),靶向泛素化為推進T細胞免疫治療提供了巨大的可能性。

蛋白質(zhì)泛素化

泛素化是一種翻譯后修飾,泛素是一種由76個氨基酸組成的小蛋白質(zhì),通常由一條泛素鏈與底物蛋白質(zhì)內(nèi)的賴氨酸殘基共價連接。泛素化通過各種方式影響蛋白質(zhì)功能,例如通過影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、周轉(zhuǎn)率、細胞定位,以及誘導(dǎo)影響與其他蛋白質(zhì)相互作用的構(gòu)象變化。

該過程由E1泛素激活酶啟動,該酶使用ATP激活,然后將泛素單體轉(zhuǎn)移到E2泛素結(jié)合酶。泛素最終在E3泛素連接酶的作用下從E2轉(zhuǎn)移到底物。

泛素化是多方面的,底物蛋白可以僅用一個泛素(單泛素化)、多個單泛素(多個單泛素化)或多泛素鏈(多泛素化)標記。由于泛素本身有七個賴氨酸(Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48和Lys63)和一個N端甲硫氨酸殘基(M1),可以進行泛素化,因此可以形成幾種結(jié)構(gòu)不同的同質(zhì)/同型、混合/異型和分支多泛素鏈。

泛素化除了是通過蛋白質(zhì)體降解蛋白質(zhì)的主要調(diào)節(jié)器外,實際上是幾乎所有細胞信號級聯(lián)的多功能調(diào)節(jié)器。泛素化蛋白質(zhì)的命運取決于添加的泛素數(shù)量和形成泛素連接的泛素氨基酸。通過這種方式,并且由于拓撲結(jié)構(gòu)不同鏈的多種可能性,泛素構(gòu)成了一種高度通用的信號。

單泛素化和多泛素化參與膜受體的內(nèi)吞作用,以及蛋白質(zhì)降解、定位和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,這些類型的鏈也與TGF-β信號傳導(dǎo)有關(guān)。在同型多泛素鏈中, Lys48和Lys63連接的鏈是最豐富,它們分別驅(qū)動蛋白酶體降解和調(diào)節(jié)多種細胞信號事件。Lys11連接鏈調(diào)節(jié)細胞周期和線粒體自噬,M1連接鏈對炎癥固有反應(yīng)至關(guān)重要,特別是調(diào)節(jié)NF-κB信號。

由Lys6-、Lys27-、Lys29-、Lys33泛素連接鏈調(diào)節(jié)的細胞過程仍然不太清楚。Lys27連接鏈似乎對調(diào)節(jié)先天免疫、細胞周期和線粒體功能非常重要。Lys6鏈似乎參與DNA修復(fù)和線粒體自噬,而Lys29鏈與Wnt信號以及蛋白毒性應(yīng)激和細胞周期相關(guān)。Lys33鏈在高爾基體后轉(zhuǎn)運和T細胞受體(TCR)調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。

此外,非常重要的是,泛素在底物上的組裝可以通過去泛素化酶(DUB)的作用逆轉(zhuǎn),去泛素化酶水解并從底物上去除泛素,使泛素化成為一種瞬時修飾,DUB對于維持生理性泛素平衡是必不可少的。這種平衡的失調(diào)與人類疾病的發(fā)病機制有關(guān),特別是癌癥、感染、神經(jīng)退行性變和免疫紊亂,因此,DUB已開始作為基于抑制劑的治療成為有吸引力的藥物靶點。

TCR/CD3激活中的泛素途徑

E3連接酶

E3泛素連接酶Casitas B系淋巴瘤(Cbl-B)是最具特征的E3連接酶,是T細胞活化的主要參與者。在T細胞激活時,它在免疫突觸處被招募到TCR中,在TCR下游發(fā)揮多種抑制機制。

Cbl-b通過其多個蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域與關(guān)鍵TCR信號體分子(如LCK、SLP76、ZAP70、Vav1、PKCθ和PI3K)相互作用。Cbl-b與E3連接酶Itch協(xié)同作用,能夠介導(dǎo)TCR-ζ的Lys33連接的多泛素化,其不針對TCR受體進行降解或內(nèi)吞,而是阻止其磷酸化并進一步與下游ZAP70激酶結(jié)合。通過這些相互作用,以及一些信號體成分的泛素化,Cbl-b強烈抑制T細胞活化。Cbl-b敲除小鼠具有過度活躍的T細胞,其激活不需要CD28,此外,Cbl-b基因敲除小鼠中從未描述過自身免疫損傷。因此,Cbl-b具有多個檢查點抑制作用和極小的自身免疫毒性,是未來靶向癌癥免疫治療的有力候選。

與淋巴細胞無能相關(guān)的基因(GRAIL)是一種跨膜E3連接酶,定位于內(nèi)體,也對T細胞活化起負調(diào)節(jié)作用。TCR介導(dǎo)的T細胞活化促進GRAIL的表達,而GRAIL反過來又阻礙T細胞活化。機制上,GRAIL通過非降解泛素鏈穩(wěn)定和激活Rho-鳥嘌呤解離抑制劑(RhoGDI),導(dǎo)致細胞骨架重排和IL-2分泌缺陷。

NRDP1是另一種損害TCR信號的E3連接酶。T細胞激活后,NRDP1將Lys33多聚泛素非降解鏈添加到ZAP70激酶。Lys33連接的泛素鏈有助于招募Sts1和Sts2磷酸酶,最終使ZAP70去磷酸化和失活。

除了作用于近端信號體外,E3連接酶還通過進一步作用于下游抑制T細胞活化,控制導(dǎo)致T細胞活化轉(zhuǎn)錄因子核易位的關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。例如,在TCR/CD28連接后,E3連接酶Pellino1(PELI1)通過用Lys48多泛素鏈標記c-Rel來阻止NF-κB通路,導(dǎo)致其蛋白酶體降解。

DUBs

去泛素化酶A20和CYLD,在調(diào)節(jié)天然免疫細胞中的NF-κB信號中具有重要作用,也能顯著改變T細胞功能。外周T細胞中A20的條件性缺失導(dǎo)致CD8+T細胞具有增強的NF-κB信號,即使在低抗原劑量下也能更有效地被激活,以產(chǎn)生更高水平的IL-2和IFN-γ。

CYLD可以通過NF-κB損害T細胞活化,它是通過將CBM復(fù)合物下游TAK1激酶的Lys63泛素鏈進行去泛素化。CYLD缺陷小鼠出現(xiàn)結(jié)腸炎,T細胞頻率和活化增加。

使用類似的作用機制,去泛素酶USP18對TAK1的去泛素化抑制TCR。USP18的基因缺失導(dǎo)致T細胞中NF-κB和NFAT的過度激活和IL-2的過度產(chǎn)生。相反,去泛素酶USP9X和USP12通過從BCL10中去除抑制性泛素鏈來積極調(diào)節(jié)NF-κB通路,從而阻斷CBM信號復(fù)合物的組裝。因此,缺乏USP9X或USP12的T細胞在TCR激活時表現(xiàn)出較低水平的NF-κB激活,以及增殖和細胞因子生成減少。

TCR內(nèi)化

TCR信號幅度和持續(xù)時間由細胞膜受體的內(nèi)化、再循環(huán)和降解的平衡決定。在抗原刺激下,TCR/CD3復(fù)合物是泛素化的,而泛素化對于表面受體的內(nèi)化至關(guān)重要。據(jù)報道,Cbl-b可單獨或與E3連接酶c-Cbl聯(lián)合促進TCR的內(nèi)化,Cbl-b還干擾激活和聚集,從而破壞免疫突觸的穩(wěn)定性,進一步減弱TCR信號。

類似地,E3連接酶GRAIL可以通過蛋白酶體多泛素化和降解CD3ζ分子來下調(diào)表面TCR/CD3復(fù)合物的表達。最近的研究表明,用于CAR-T治療的CAR受體的表面表達也受到泛素介導(dǎo)的內(nèi)吞和降解的影響。注入患者體內(nèi)的CAR-T細胞持續(xù)性差是這種腫瘤免疫療法的主要限制。最近的一項研究能夠通過對細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的所有賴氨酸殘基進行突變來提高CAR的穩(wěn)定性,這有效地繞過了CARs的泛素化依賴性溶酶體降解,因此,這些CAR-T細胞改善了CAR的持久性和來自內(nèi)體的信號傳導(dǎo),同時增強了效應(yīng)器功能,從而在小鼠模型中產(chǎn)生持久的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

共刺激受體下游的泛素途徑

CD28

E3連接酶Cbl-b是CD28介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的主要抑制劑,從機制上講,E3連接酶Cbl-b通過結(jié)合和泛素化PI3K的p85β亞單位來抑制CD28依賴的PI3K途徑。

E3連接酶不僅能阻礙CD28信號傳導(dǎo),而且能促進CD28信號傳導(dǎo)。例如,TCR/CD28激活NFAT涉及E3連接酶TRAF6。TRAF6被招募到免疫突觸與支架蛋白LAT相互作用,并通過Lys63泛素化增強LAT磷酸化和TCR信號。

為了充分激活T細胞,CD28共受體必須克服Cbl-b抑制。CD28信號通過觸發(fā)Cbl-b的翻譯后修飾來阻斷Cbl-b抑制途徑,最終導(dǎo)致其蛋白酶體降解。其中E3連接酶NEDD4發(fā)揮著重要作用,據(jù)報道NEDD4在CD28共刺激下結(jié)合并泛素化Cbl-b進行蛋白酶體降解。

其他共刺激受體

與CD28類似,腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族成員的共刺激受體4-1BB、CD40L、OX40和GITR與TCR協(xié)同促進T細胞活化,尤其是增殖和細胞因子的產(chǎn)生。作為TNFRs,它們?nèi)狈��?nèi)在的酶功能,依賴于幾種E3連接酶,包括TRAF(TRAF1/2/3)、cIAP1/2和LUBAC,在導(dǎo)致NF-κB活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)中引導(dǎo)大量Lys63、Lys48和線性泛素化事件。去泛素酶A20、CYLD和OTULIN可以清除這些泛素化事件以阻止NF-κB的活化。

抑制性受體下游泛素途徑

CTLA-4

到目前為止,沒有任何E3直接泛素化CTLA-4的報道,也沒有CTLA-4中泛素化位點的記錄。然而,CTLA-4缺陷型T細胞的泛素修飾總體上顯著減少,這有力地表明了泛素化事件在CTLA-4途徑中的重要性。此外,實驗證據(jù)表明,主要CTLA-4抑制功能由關(guān)鍵的T細胞抑制性E3連接酶介導(dǎo),該連接酶也調(diào)節(jié)T細胞活化,即Cbl-b、ITCH和GRAIL。

此外,Cbl-b、ITCH和GRAIL是T細胞無能的基本驅(qū)動因素,而且這三種E3連接酶還通過調(diào)節(jié)Treg的發(fā)育和功能發(fā)揮重要的免疫抑制作用。Cbl-b和ITCH參與TGF-β介導(dǎo)的Foxp3調(diào)節(jié),缺乏這兩種E3連接酶都會損害TGF-β誘導(dǎo)的Foxp3+Tregs(iTreg)的發(fā)育,導(dǎo)致iTreg低表達,功能缺陷。

PD-1

與CTLA-4不同,一些報告強調(diào)了泛素化在PD-1/PD-L1系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用。對于T細胞上的PD-1受體,Cbl-b也作為PD-1抑制途徑的關(guān)鍵介質(zhì)顯著參與,缺乏Cbl-b的T細胞對PD-1抑制具有抵抗力。沒有Cbl-b,PD-1在抑制IFN-γ產(chǎn)生或誘導(dǎo)T細胞活化后的細胞死亡方面效率低下。

另一種Cbl E3連接酶c-Cbl也影響PD-1,但與Cbl-b相反,它是一種負性調(diào)節(jié)因子。c-Cbl與PD-1的胞質(zhì)尾部結(jié)合,并作為E3連接酶,泛素化PD-1進行蛋白酶體降解。因此,c-Cbl減少提高了CD8+T細胞和巨噬細胞中PD-1的表達。

同樣,E3連接酶FBXO38通過介導(dǎo)PD-1降解來控制T細胞抗腫瘤反應(yīng)。從機理上講,FBXO38通過在Lys233處添加Lys48多聚泛素鏈來標記PD-1進行降解。缺乏FBXO38的黑色素瘤和結(jié)直腸癌小鼠模型具有更高的腫瘤負荷,這與腫瘤浸潤性T細胞中PD-1的高表達有關(guān)。

PD-L1

PD-L1的腫瘤水平是腫瘤免疫的重要決定因素。幾項研究已確定癌細胞利用EGFR信號穩(wěn)定PD-L1表達以逃避T細胞免疫。E3連接酶識別并泛素標記PD-L1進行蛋白水解,主要依賴于糖原合成酶激酶3(GSK3α/β)。GSK3β磷酸化PD-L1的C端結(jié)構(gòu)域,以招募E3連接酶β-TrCP用于PD-L1泛素依賴性降解。而EGFR信號通過誘導(dǎo)GSK3β磷酸化位點附近的PD-L1大量糖基化來對抗GSK3β/β-TrCP/PD-L1降解途徑。

另一項研究進一步表明GSK3α/ARIH1是另一種誘導(dǎo)PD-L1蛋白水解的激酶/E3連接酶對。E3連接酶ARIH1識別S279/S283處PD-L1的GSK3α依賴性磷酸化,隨后PD-L1 Lys48泛素化和降解。最近,還發(fā)現(xiàn)EGFR通過額外干擾膜結(jié)合MARCH8 E3連接酶增加PD-L1水平,該連接酶也以PD-L1為降解靶點。最后,c-Cbl過表達,單獨或與Cbl-b聯(lián)合,也可以降低STAT3/AKT/ERK磷酸化,從而下調(diào)PD-L1表達并增加抗腫瘤反應(yīng)。

Cullin3 SPOP和TRIM21E3連接酶通過泛素化依賴性降解進一步破壞PD-L1的穩(wěn)定性,它們的作用再次依賴于激酶,特別是細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4和CDK5。然而,CDK4通過穩(wěn)定Cullin3 SPOP協(xié)助PD-L1降解,而CDK5則消極干擾TRIM21對PD-L1的作用。

此外,PD-L1也因其他幾種去泛素化酶而穩(wěn)定,即OTUB1、USP9X、USP7。這些研究具有潛在的治療意義,因為它們證明,抑制或清除這些DUB中的任何一種都可以重新激發(fā)小鼠的抗腫瘤反應(yīng),并使癌細胞對T細胞殺傷敏感。

泛素依賴途徑腫瘤藥物的開發(fā)

到目前為止,針對泛素依賴的途徑主要是基于小分子抑制劑,這些小分子可以通過直接結(jié)合或變構(gòu)作用阻斷泛素相關(guān)酶的催化結(jié)構(gòu)域,或阻止其與底物或其他調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合。目前,已經(jīng)開發(fā)了200多種化合物,其中許多化合物正在進行癌癥治療的臨床前和臨床試驗。

大多數(shù)基于泛素的小分子化合物被設(shè)計成靶向癌細胞中必需的泛素途徑。隨著以T細胞為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療的出現(xiàn),針對選擇性E3和DUB的靶向抑制已有研究,其中關(guān)鍵的細胞內(nèi)檢查點T細胞抑制劑Cbl-b具有巨大的潛力。已有研究利用RNA干擾成功地下調(diào)了T細胞中的Cbl-b水平,這在不同的過繼性T細胞轉(zhuǎn)移腫瘤模型中產(chǎn)生了出色的體外和臨床前結(jié)果,并且癌癥患者對其耐受性良好,目前已進入臨床試驗(NCT02166255和NCT03087591)。此外,針對IAPs、MDM2和USP7的小分子已經(jīng)進行了臨床前試驗,并證明單獨使用或聯(lián)合使用時,至少部分增強體內(nèi)抗腫瘤免疫。

調(diào)節(jié)癌細胞中PD-L1降解的泛素化依賴途徑也正在進行測試。例如,一種競爭性棕櫚�；�抑制劑(CPP-S1),以防止PD-L1棕櫚�；�,進而促進PD-L1泛素介導(dǎo)的降解�？刂芇D-L1泛素化和降解的EGFR信號通路也通過不同的方式在體內(nèi)被有效阻斷,包括EGFR小分子抑制劑、銅螯合劑和靶向CSN5的小分子,都顯著增強T細胞抗腫瘤反應(yīng)。

基于鄰近性的治療方法,包括PROTAC或分子膠技術(shù),也正在迅速發(fā)展,以針對幾種特定腫瘤蛋白質(zhì)的蛋白酶體降解,目前有十幾項臨床試驗正在驗證這些基于泛素化技術(shù)的治療潛力。

小結(jié)

數(shù)據(jù)表明,調(diào)節(jié)幾種泛素依賴性途徑,特別是所涉及的泛素依賴性酶,可以釋放強烈、持久和靶向的抗腫瘤反應(yīng)。目前,泛素領(lǐng)域也取得了巨大進展,開發(fā)出了多種新技術(shù)和新方法,可以專門針對幾乎所有泛素依賴的酶,或者利用它們針對感興趣的底物蛋白,包括腫瘤蛋白。展望未來,相信這些重要的泛素依賴途徑的調(diào)節(jié)很快將成為改善靶向腫瘤免疫治療的可行替代方案。

參考文獻:

1．Ubiquitination in T-Cell Activation andCheckpoint Inhibition: New Avenues for Targeted Cancer Immunotherapy． Int J MolSci． 2021 Oct; 22(19): 10800．