BACKGROUND INTRODUCTION

利用豐富廉價(jià)的碳源可以有效降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)可行性。其中，醋酸鹽就是一種非常有前途的碳源，通常以較高濃度存在于廢物和生物質(zhì)的水解產(chǎn)物中。

衣康酸學(xué)名為甲叉琥珀酸，亞甲基丁二酸，是不飽和二元有機(jī)酸。它含不飽和雙鍵，具有活潑的化學(xué)性質(zhì)，可進(jìn)行自身間的聚合，也能與其他單體如丙烯腈等聚合；能進(jìn)行各種加成反應(yīng)，酯化反應(yīng)和聚合反應(yīng)，是化學(xué)合成工業(yè)的重要原料，也是化工生產(chǎn)的重要原料，可用作酸味劑、pH調(diào)節(jié)劑、金屬螯合劑等。

在2004年，美國能源部將衣康酸評(píng)選為12種最具發(fā)展?jié)摿Φ纳�物質(zhì)來源平臺(tái)化合物之一。衣康酸主要通過絲狀真菌土曲霉（Aspergillus terreus）的發(fā)酵產(chǎn)生。然而，由于發(fā)酵過程復(fù)雜、菌體生長(zhǎng)緩慢、蛋白酶系統(tǒng)復(fù)雜、發(fā)酵過程持續(xù)需氧量高、生產(chǎn)成本高、副產(chǎn)物難以控制，以及缺乏有效的基因工程工具等因素，導(dǎo)致土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸水平受到了限制，40余年里產(chǎn)量都沒有明顯的提升。隨著基因工程、合成生物學(xué)及系統(tǒng)生物學(xué)的飛速發(fā)展，越來越多的研究者將目光聚焦于其他底盤細(xì)胞，將衣康酸合成途徑構(gòu)建在異源細(xì)胞中，如大腸桿菌、酵母細(xì)胞和谷氨酸棒狀桿菌等，以期提升工業(yè)衣康酸的產(chǎn)能。

2018年，韓國浦項(xiàng)科技大學(xué)（Pohang University of Science and Technology）的Myung Hyun Noh等人，在《Biotechnology and Bioengineering》雜志（IF3．952；工程技術(shù)2區(qū)）發(fā)表了題為“Production of itaconic acid from acetate by engineering acid－tolerant Escherichia coli W ”的文章。

所用到的主要方法

METHODS

1．HPLC：采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。適用于溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性的限制，用途廣泛。

2．LC－MS：質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測(cè)量各種離子譜峰的強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)分析目的的一種分析方法。液質(zhì)連用實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析。而且也簡(jiǎn)化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡(jiǎn)便。

3．real－time PCR：是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異。

4．異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）測(cè)定：ICL催化異檸檬酸降解為乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm 下有特征吸收峰，監(jiān)測(cè)340nm吸光度的減小速率可間接反應(yīng)ICL 活性。

ABSTRACT

利用豐富廉價(jià)的碳源可以有效降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)可行性。醋酸鹽是一種很有前途的碳源，可以實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)有效的微生物轉(zhuǎn)化過程。在這項(xiàng)研究中，作者設(shè)計(jì)了一種從醋酸鹽生產(chǎn)衣康酸的大腸桿菌菌株。由于已知醋酸鹽抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，作者首先篩選出具有高度耐受醋酸鹽特性的大腸桿菌菌株，并最終選擇W菌株作為后續(xù)研究所用的宿主。隨后，通過使用合成的啟動(dòng)子和5＇UTR（非翻譯區(qū)）來過表達(dá)cad基因（編碼順烏頭酸脫羧酶）獲得WC菌株。然而，由于醋酸鹽吸收低，WC菌株僅產(chǎn)生0．13g ／ L衣康酸。為了改善產(chǎn)量，進(jìn)一步通過途徑基因的過表達(dá)以及其失調(diào)來擴(kuò)增乙酸（即醋酸）同化途徑和乙醛酸分流途徑。所得菌株WCIAG4在用醋酸鹽為唯一碳源發(fā)酵88小時(shí)后，可產(chǎn)生3．57g ／ L衣康酸（理論最大產(chǎn)率的16．1％）。這一研究也表明：醋酸鹽可以成為工程化大腸桿菌生物化學(xué)生產(chǎn)的潛在原料。