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通過(guò)整合基因組分析以鑒定肺腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞異質(zhì)性和血管生成候選物

2021-01-07 11:35
科研菌
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附圖1D:在患者標(biāo)本中對(duì)于所有細(xì)胞的聚類(lèi)結(jié)果

對(duì)于無(wú)法通過(guò)自舉分析分離的的生物學(xué)相關(guān)亞型(例如,來(lái)自腫瘤和腫瘤周?chē)M織的淋巴EC),作者根據(jù)先前的研究,確定它們?cè)诮y(tǒng)計(jì)學(xué)上是可以使用成對(duì)差異分析來(lái)分離的。13個(gè)表型中的每一個(gè)都按圖1C所示編號(hào)(H1,H2等)。

作者根據(jù)hPNEC和hTEC中排名最高的標(biāo)記基因的相對(duì)豐度對(duì)亞型進(jìn)行生物學(xué)注釋?zhuān)?duì)顯著的標(biāo)記基因表達(dá)水平差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)量化以支持定性生物學(xué)注釋?zhuān)▓D1D–1G和S1E)。

圖1D:t-SNE聚類(lèi)后的亞群標(biāo)記基因的表達(dá)分布情況 

E:標(biāo)記基因在不同亞組中的表達(dá)熱圖 

F:在hTECs和hpNECs不同EC亞型的占比 

G:每種亞型在hTEC和hpNEC中的占比情況

為了獲得更可靠的解釋?zhuān)髡哧P(guān)注不同亞型的特異基因集并基于規(guī)范的基因集(表S5)對(duì)亞型進(jìn)行分析。為了提高分析的通用性,所有聚類(lèi)的分類(lèi)都被分析了至少一次。

作者對(duì)先前記錄亞組中排名最高的標(biāo)記基因作用的詳細(xì)描述,用于推斷每個(gè)亞型的假定生物學(xué)作用。

表S5(部分):用于定義聚類(lèi)的基因集

作者對(duì)于每一個(gè)聚類(lèi)的通過(guò)其高表達(dá)基因集進(jìn)行了生物學(xué)功能的分析:

動(dòng)脈EC(簇H1)表達(dá)的基因涉及血管完整性,體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和血管收縮(圖2A),而毛細(xì)血管后靜脈EC(H2)表達(dá)的基因與白細(xì)胞募集,組織灌注和肺動(dòng)脈血壓有關(guān)(圖2B)。

作者確定了I型(H3)和II型(H4)肺泡毛細(xì)血管EC表型,其特征在于血管性血友病因子(vWF,II型相比I型上調(diào);倍數(shù)= 3.63,adj.p<0.001)和黏蛋白(EMCN,I型與II型相比上調(diào);倍數(shù)= 2.89,adj.p<0.001),它們可能分別參與血管調(diào)節(jié)和抗微生物防御(圖2C–  2E)。

與所有其他簇相比,毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)了參與MHC-II介導(dǎo)的抗原呈遞和加工的基因,其表達(dá)水平高于其他表型(圖2F),但共刺激分子CD80和CD86卻未檢測(cè)到,提示其具有專(zhuān)職抗原呈遞細(xì)胞(APC)的功能。

確定了2種可能由腫瘤源性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的新型毛細(xì)血管表型:清除毛細(xì)血管(scavenging capillaries )(H5)在自舉分析結(jié)果中顯示出類(lèi)似于II型毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的特征,而其清除受體和與巨噬細(xì)胞及抗原加工相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)(圖2G,2H 和S1D),激活毛細(xì)血管(H6)則表達(dá)EC激活標(biāo)記(圖2I)。

中間毛細(xì)血管EC表型(H7)類(lèi)似于活化的毛細(xì)血管,但其主要由單個(gè)患者衍生的細(xì)胞組成。

圖2:肺正常組織EC各亞型的基因表達(dá)差異情況

作者隨后探究了在腫瘤組織中特異性的EC,結(jié)果顯示:

傳統(tǒng)的血管生成表型,例如tip和增生的EC(假定為抗血管生成治療[AAT]的靶標(biāo)),僅在hTEC中可檢測(cè)到(圖3A,S1E和S2A)。tip EC(H8)與EC遷移,基質(zhì)重塑和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因特征相關(guān)(圖3B),但其僅在少數(shù)(<10%)hTEC中被檢測(cè)到(圖S1E)。

值得注意的是,tip hTECs顯示出疾病特異性分子PGF(胎盤(pán)生長(zhǎng)因子;PlGF )的高度限制表達(dá)。

發(fā)現(xiàn)了一個(gè)不成熟的hTEC表型(H9)與tip  EC相似,但是其上調(diào)的基因參與了新生血管的成熟,血管屏障完整性和Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),作者推測(cè)其可能類(lèi)似于莖狀EC(圖3C和S1D) 。

僅在一部分患者中檢測(cè)到增殖的hTECs,占hTECs的<1%,并且在批量校正后不再作為單獨(dú)的簇被檢測(cè)到(圖S2A)。

在hTECs中,激活的毛細(xì)血管后靜脈表型(H10)上調(diào)表達(dá)了免疫調(diào)節(jié)因子和核糖體蛋白(圖3D),這是發(fā)炎組織中高內(nèi)皮小靜脈(HEVs)的特征。

與血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛的表型異質(zhì)性相反,腫瘤和腫瘤周?chē)馨蛢?nèi)皮細(xì)胞(LEC;H11,H12)的基因表達(dá)特征高度相似,并且未檢測(cè)到LEC亞群(圖3E和S1)。

圖3:A:hnNEC與hTEC之間的EC表型差異 

D-C:不同EC之間的基因表達(dá)差異

附圖2A:各樣品中增殖EC的存在情況

為了探索本研究中采用的NSCLC EC分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)的通用性,作者使用了排名最高的標(biāo)記基因來(lái)訓(xùn)練機(jī)器學(xué)習(xí)算法,以自動(dòng)注釋方式從來(lái)自5位未接受過(guò)治療的NSCLC患者(公開(kāi)數(shù)據(jù)集)的腫瘤的52,698個(gè)細(xì)胞目錄中以計(jì)算機(jī)方式注釋574個(gè)hPNEC和638個(gè)hTEC。大多數(shù)EC分類(lèi)具有高置信度注釋?zhuān)ㄏ嗨菩蚤撝担?0.5)(圖3F),這表明分類(lèi)法是外部有效的。

圖3F:將hTEC和hPNEC表型與組織分類(lèi)相關(guān)聯(lián)的;鶊D

作者使用正交技術(shù)以驗(yàn)證分類(lèi)法的可靠性,通過(guò)免疫染色結(jié)合定量RNA雜交計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)錄本數(shù)期望證實(shí)CD31 + / CXCR4高tip hTECs中的PGF水平被上調(diào)

免疫染色:

三重免疫染色顯示CXCR4和PlGF在TEC中共定位(圖3G和3H; S2B)。

SELP的免疫染色證實(shí)了激活的毛細(xì)血管后靜脈EC的特征(圖S2C和S2D)

vWF和EFNB2分別為靜脈和動(dòng)脈表型(圖S2E–S2H)

HEV特異性MECA-79抗原是HEV表型的特征(圖S2I)

圖3G:細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄本PGF和CXCR4的表達(dá)情況及計(jì)數(shù)

圖3H:NSCLC腫瘤血管的RNAscope圖像(CXCR4(白色)PGF(綠色)CD31(紅色)細(xì)胞核(Hoechst))

附圖2B:對(duì)CD31,PLGF和CXCR4免疫染色的人NSCLC腫瘤切片的代表性顯微照片

附圖2C-H:NSCLC腫瘤切片(左)正常肺(右側(cè))的免疫熒光照片 

I:對(duì)CD31和MECA79免疫染色的人NSCLC腫瘤切片照片

RNAscope:

RNAscope結(jié)合EC標(biāo)記CD31的染色顯示,動(dòng)脈(EFNB2)和靜脈(ACKR1)標(biāo)記轉(zhuǎn)錄本不在同一hTEC中共定位(圖S3A和S3B)

活化毛細(xì)血管hTECs表達(dá)了標(biāo)記CCL14(圖S3C)。

清除毛細(xì)血管標(biāo)記CD52和CD68以及I型毛細(xì)管標(biāo)記EDNRB和IL1RL1的轉(zhuǎn)錄本共定位在同一hTEC中(圖S3D和S3E)。

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