毛細(xì)血管后靜脈mTECs上調(diào)了HEV標(biāo)記（圖S5J和S5K），通過免疫染色證實(shí)（圖S6A和S6B）。

圖S6：針對(duì)不同靶位的免疫染色的健康鼠肺（左）和鼠肺腫瘤切片（右）的免疫熒光照片

其余的鼠表型主要在mTECs中檢測(cè)到（圖5C和S5F）。

新指骨mTEC表型（M12）表達(dá)毛細(xì)血管和小動(dòng)脈標(biāo)記，而激活的動(dòng)脈mTECs（M13）中觀察到新動(dòng)脈生成標(biāo)記上調(diào)。

值得注意的是，只有mTECs，而不是mNECs，表現(xiàn)出以干擾素（IFN）響應(yīng)和趨化因子的表達(dá)為特征的表型，參與免疫細(xì)胞募集和血管阻滯（M14）（圖S5C）。

確定了以前無法識(shí)別的EC表型，作者將其稱為突破細(xì)胞（M15），以及它們的推定前體，先裂解細(xì)胞（M16）（圖5E－5G）。

突破細(xì)胞不僅上調(diào)TEC末端標(biāo)記的表達(dá)，而且還上調(diào)VEGF誘導(dǎo)的足突玫瑰花介導(dǎo)的基底膜（BM）和膠原蛋白重塑的基因的表達(dá)。

免疫染色證實(shí)了蛋白質(zhì)水平上的動(dòng)脈，毛細(xì)血管，靜脈和tipmNEC和mTEC表型的標(biāo)志物表達(dá)（圖S6C–S6J）。

在培養(yǎng)的hcTEC中，體內(nèi)的動(dòng)脈，毛細(xì)血管和靜脈EC表型不再可檢測(cè)到（圖S7A和S7B）。

圖S7：A：培養(yǎng)的hcTEC的聚類情況 

B：標(biāo)記基因在不同亞組中的表達(dá)熱圖

在hcTECs中可檢測(cè)到典型的tipEC表型（C1），這是一種可塑瞬時(shí)表型（plastic transient phenotype ）。

如在培養(yǎng)中的EC繁殖中所預(yù)期的，檢測(cè)到了增殖的hcTEC（C2）。可能與培養(yǎng)條件有關(guān)（存在轉(zhuǎn)化生長因子b，血清中內(nèi)皮－成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)劑）

鑒定到表現(xiàn)出內(nèi)皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化特征的表型（C3）（TAGLN，SERPINE1，F(xiàn)N1，CD44，）。

檢測(cè)到一個(gè)上調(diào)核糖體基因的中間過渡表型（C4），表明EC表型正在采用另一種表型（圖S7B）。

４．VEGF阻斷劑對(duì)TEC表型差異敏感性的影響

使用mTEC分類法，作者探討了特定的EC表型是否對(duì)抗VEGF AAT敏感（VEGFR2抗體［DC101］，VEGFR酪氨酸激酶抑制劑［PTK787］）（圖5H）。這些化合物的劑量都達(dá)到抑制病理性血管生成并減少腫瘤中的EC數(shù)量的并抑制腫瘤的生長水平（圖S7C）。

圖5H：不同藥物治療后mTEC表型的相對(duì)組成

圖S7：治療后的腫瘤重量比較

對(duì)照和AAT處理后的EC依舊有相同的cluster組成（圖5H），表明AAT不會(huì)改變不同EC表型的整體轉(zhuǎn)錄組特征。

對(duì)單個(gè)EC表型的量化顯示，tip 和突破TECs最敏感。毛細(xì)血管后靜脈和增殖的TEC對(duì)VEGF阻滯較不敏感，而毛細(xì)血管TEC對(duì)PTK787治療較不敏感（圖5H），尚不清楚這是否是由于腫瘤從血管發(fā)芽轉(zhuǎn)變?yōu)檠�管選擇所導(dǎo)致的。

5．腫瘤血管紊亂的分子特征和VEGF阻斷的作用

腫瘤血管結(jié)構(gòu)混亂且功能異常，但缺乏詳細(xì)的無偏分子足跡分析。傳統(tǒng)上，AAT被認(rèn)為可以修剪血管生成的EC，VEGF阻斷療法也被認(rèn)為可以使異常的血管系統(tǒng)正�；�。

作者探討了抗VEGF治療是否通過誘導(dǎo)更細(xì)微的基因表達(dá)變化來達(dá)成EC阻滯作用：

首先通過在成對(duì)差異分析中比較血管生成和非血管生成的表型來構(gòu)建“正�！焙汀澳[瘤血管紊亂”的基因特征，以鑒定差異表達(dá)的基因（經(jīng)校正的p值＜0．01，｜FC｜＞1．5）。比較發(fā)現(xiàn)分別有18個(gè)和28個(gè)基因的表達(dá)水平顯著升高，分別處于紊亂（tip，突破和未成熟的EC標(biāo)記基因）和正常（包括毛細(xì)血管標(biāo)記基因）表型中（圖5I，5J，S7D和表S4）。

圖5：I：18個(gè)紊亂基因signature在不同處理組的表達(dá)水平 

J：紊亂基因signature中的基因的表達(dá)水平（黑色虛線左側(cè)）和正常的signature（黑色虛線右側(cè)）的表達(dá)水平，藥物處理對(duì)這些特征的影響

使用18個(gè)紊亂基因signature的GSVA顯示，腫瘤血管的紊亂被VEGF阻斷部分逆轉(zhuǎn)（圖5I和5J）。

圖S7E－F：藥物影響后的基因改變GSVA分析

兩種VEGFR抑制劑均降低了末端EC基因signature的表達(dá)（糖酵解；BM重塑）

同時(shí)增加了與成熟的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)功能相關(guān)的signature的表達(dá)（抗原呈遞，屏障， 和血管發(fā)育）（圖S7E和S7F）。

因此，VEGF阻斷不僅修剪，而且還調(diào)節(jié)了TECs以促進(jìn)具有穩(wěn)態(tài)功能的更靜態(tài)和成熟的腫瘤脈管系統(tǒng)，表明部分腫瘤血管分子正�；�。

6．保守的TEC表型和tip EC標(biāo)記物的鑒定

先前的研究發(fā)現(xiàn)，替代性促血管生成信號(hào)的上調(diào)會(huì)使抗VEGF療法的療效受到耐藥性的限制。

為了確定備選的血管生成候選物，作者假設(shè)跨物種和模型保守的TEC表型以及一致表達(dá)的基因可能是更穩(wěn)定的血管生成候選物。

因此，作者進(jìn)行了整合的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)，本體多組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)薈萃分析，以識(shí)別此類候選基因（圖S8A）。

圖S8A：整合分析流程

作者使用scRNA－seq數(shù)據(jù)來評(píng)估跨物種和模型的血管生成EC表型的相似性，使用標(biāo)記基因集的成對(duì)Jaccard相似系數(shù)并應(yīng)用主成分分析（PCA）進(jìn)行可視化（圖6A和S8A）。

圖6A：針對(duì)跨物種的EC主成分分析

在體外，hcTECs失去了體內(nèi)動(dòng)脈，毛細(xì)血管和靜脈的表型。體內(nèi)hTECs和mTECs和末端EC轉(zhuǎn)錄組signature在培養(yǎng)的hcTEC中是保守的。

僅在培養(yǎng)的和小鼠的TEC以及某些NSCLC患者的hTEC中檢測(cè)到具有增殖特征的EC。

新鮮分離的人靜脈和鼠類未成熟TECs，以及中間的hcTECs高度表達(dá)核糖體基因，提示可塑性表型，并過渡到其他血管生成EC表型。

除了tip TEC ，其他表型都是模型或物種特異性的。由于tip TEC在所有測(cè)試的物種和模型中均表達(dá)了相似的標(biāo)記基因標(biāo)記，因此作者著重于確定一致的tip TEC標(biāo)記。

為了構(gòu)建tip TEC標(biāo)記的排名列表，作者首先選擇了296個(gè)保守的tip EC中富集的基因，這些基因在物種和模型的tip TEC中始終表達(dá)最高。

其次，對(duì)于每個(gè)保守基因，作者通過計(jì)算3個(gè)數(shù)據(jù)集中的每個(gè)標(biāo)記基因等級(jí)的乘積來定義等級(jí)得分（在此列表中，始終在tip EC中上調(diào)最高的基因中的基因排名最高）（圖 6B）。

圖6B：保守的tip EC標(biāo)記基因的一致性得分條形圖 

上圖：按指示的生物學(xué)過程分類的50個(gè)排名最高的標(biāo)記基因 

下圖：它們與基準(zhǔn)數(shù)據(jù)集的交集

作者提取了在排名前50位的富集signature進(jìn)行后續(xù)分析。

這些富集的signature包含了先前在tipEC中檢測(cè)到的tip EC標(biāo)記（ANGPT2，APLN，F(xiàn)SCN1，PGF，PLXND1，ADM，PDGFB，CXCR4等），但不一定在表達(dá)模式和功能水平上進(jìn)一步表征。

50個(gè)排名最高的基因中有一半以前沒有被描述為tip TEC標(biāo)記（在腫瘤或生理性血管生成中EC的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中未檢測(cè)到）。

一致的末端TEC標(biāo)記與遷移的末端EC表型相關(guān)，包括層粘連蛋白（LAMA4，LAMC1，LAMB1），基質(zhì)細(xì)胞蛋白（SPARC，LXN），細(xì)胞骨架相關(guān)基因（VIM，MARCKS，MYH9，MYO1B）和細(xì)胞粘附分子（CD93，  MCAM，ITGA5）。

確定了新的tip TEC豐富的轉(zhuǎn)錄因子（TCF4，SOX4，SMAD1）。

腫瘤中紊亂的血管結(jié)構(gòu)阻礙了tipTEC的形態(tài)學(xué)鑒定：圖S6J（見上）顯示了tip EC標(biāo)記物的異質(zhì)表達(dá)，但標(biāo)志物在腫瘤血管發(fā)芽的最前端及其在形態(tài)學(xué)tip EC中的表達(dá)不能被明確鑒定。

因此，作者使用了產(chǎn)后視網(wǎng)膜血管生成模型來驗(yàn)證LXN（Latexin）和FSCN1（Fascin）在血管前端的tipEC中的表達(dá)（圖S8B）。為了證明其功能作用，作者研究了沉默這些tip細(xì)胞標(biāo)記是否會(huì)影響tip細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)能力。

圖S8B：出生后第5天，固定物異凝集素B4染色指示脈管系統(tǒng)及LXN或FSCN1的免疫染色

作者沉默了人臍靜脈EC（HUVEC；＞ 70％–80％的沉默效率；圖S8C）中的LXN（ ［shRNA］敲低）或FSCN1（siRNA沉默）表達(dá)，并生成了包含1：1對(duì)照野生型HUVEC（紅色）、FSCN1（綠色）和被LXN沉默的HUVEC混合物的鑲嵌球體。沉默的細(xì)胞很少出現(xiàn)在尖端位置，這證實(shí)了這些標(biāo)記物在tip EC中的作用（圖6C和6D）。

圖6C－D：C：LXNKD D：FSCN1 

照片：EC橢球的代表性顯微照片 右：對(duì)具有指定基因型的tip細(xì)胞的分?jǐn)?shù)進(jìn)行定量7．綜合分析強(qiáng)調(diào)膠原蛋白修飾參與血管生成的作用

編碼膠原蛋白（COL4A1，COL4A2，COL18A1）的基因在最一致的tip EC標(biāo)記中排名前10位，而其他膠原蛋白修飾（交聯(lián)）酶（PXDN，PLOD1）則排名前50位（圖6B，見上）。

對(duì)13名獨(dú)立的NSCLC患者進(jìn)行bulk RNAseq和驗(yàn)證性RT－PCR分析表明， TECs中參與膠原蛋白交聯(lián)及羥化水平的基因（LOXL2PLOD1－3）表達(dá)高于NECs（圖6E和6F）。

圖6E－F：通過（E）bulk－RNAseq或（F）qRT－PCR的編碼膠原羥基化和交聯(lián)酶的基因的表達(dá)水平

為了探討其他腫瘤類型的TECs中膠原修飾酶是否上調(diào)，作者對(duì)來自五種癌癥患者的bulk RNAseq公開數(shù)據(jù)集中的NEC與TEC進(jìn)行了整合分析。

在此分析中，編碼膠原蛋白修飾酶的轉(zhuǎn)錄物同樣被富集（對(duì)于所有基因，p ＜0．05），并排在TEC中最一致上調(diào)的基因的前1％–5％之間（圖6G）。

圖6G：排位與富集得分圖