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通過整合基因組分析以鑒定肺腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞異質(zhì)性和血管生成候選物

2021-01-07 11:35
科研菌
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毛細(xì)血管后靜脈mTECs上調(diào)了HEV標(biāo)記(圖S5J和S5K),通過免疫染色證實(shí)(圖S6A和S6B)。

圖S6:針對(duì)不同靶位的免疫染色的健康鼠肺(左)和鼠肺腫瘤切片(右)的免疫熒光照片

其余的鼠表型主要在mTECs中檢測(cè)到(圖5C和S5F)。

新指骨mTEC表型(M12)表達(dá)毛細(xì)血管和小動(dòng)脈標(biāo)記,而激活的動(dòng)脈mTECs(M13)中觀察到新動(dòng)脈生成標(biāo)記上調(diào)。

值得注意的是,只有mTECs,而不是mNECs,表現(xiàn)出以干擾素(IFN)響應(yīng)和趨化因子的表達(dá)為特征的表型,參與免疫細(xì)胞募集和血管阻滯(M14)(圖S5C)。

確定了以前無法識(shí)別的EC表型,作者將其稱為突破細(xì)胞(M15),以及它們的推定前體,先裂解細(xì)胞(M16)(圖5E-5G)。

突破細(xì)胞不僅上調(diào)TEC末端標(biāo)記的表達(dá),而且還上調(diào)VEGF誘導(dǎo)的足突玫瑰花介導(dǎo)的基底膜(BM)和膠原蛋白重塑的基因的表達(dá)。

免疫染色證實(shí)了蛋白質(zhì)水平上的動(dòng)脈,毛細(xì)血管,靜脈和tipmNEC和mTEC表型的標(biāo)志物表達(dá)(圖S6C–S6J)。

在培養(yǎng)的hcTEC中,體內(nèi)的動(dòng)脈,毛細(xì)血管和靜脈EC表型不再可檢測(cè)到(圖S7A和S7B)。

圖S7:A:培養(yǎng)的hcTEC的聚類情況 

B:標(biāo)記基因在不同亞組中的表達(dá)熱圖

在hcTECs中可檢測(cè)到典型的tipEC表型(C1),這是一種可塑瞬時(shí)表型(plastic transient phenotype )。

如在培養(yǎng)中的EC繁殖中所預(yù)期的,檢測(cè)到了增殖的hcTEC(C2)。可能與培養(yǎng)條件有關(guān)(存在轉(zhuǎn)化生長因子b,血清中內(nèi)皮-成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)劑)

鑒定到表現(xiàn)出內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化特征的表型(C3)(TAGLN,SERPINE1,F(xiàn)N1,CD44,)。

檢測(cè)到一個(gè)上調(diào)核糖體基因的中間過渡表型(C4),表明EC表型正在采用另一種表型(圖S7B)。

4.VEGF阻斷劑對(duì)TEC表型差異敏感性的影響

使用mTEC分類法,作者探討了特定的EC表型是否對(duì)抗VEGF AAT敏感(VEGFR2抗體[DC101],VEGFR酪氨酸激酶抑制劑[PTK787])(圖5H)。這些化合物的劑量都達(dá)到抑制病理性血管生成并減少腫瘤中的EC數(shù)量的并抑制腫瘤的生長水平(圖S7C)。

圖5H:不同藥物治療后mTEC表型的相對(duì)組成

圖S7:治療后的腫瘤重量比較

對(duì)照和AAT處理后的EC依舊有相同的cluster組成(圖5H),表明AAT不會(huì)改變不同EC表型的整體轉(zhuǎn)錄組特征。

對(duì)單個(gè)EC表型的量化顯示,tip 和突破TECs最敏感。毛細(xì)血管后靜脈和增殖的TEC對(duì)VEGF阻滯較不敏感,而毛細(xì)血管TEC對(duì)PTK787治療較不敏感(圖5H),尚不清楚這是否是由于腫瘤從血管發(fā)芽轉(zhuǎn)變?yōu)檠苓x擇所導(dǎo)致的。

5.腫瘤血管紊亂的分子特征和VEGF阻斷的作用

腫瘤血管結(jié)構(gòu)混亂且功能異常,但缺乏詳細(xì)的無偏分子足跡分析。傳統(tǒng)上,AAT被認(rèn)為可以修剪血管生成的EC,VEGF阻斷療法也被認(rèn)為可以使異常的血管系統(tǒng)正;。

作者探討了抗VEGF治療是否通過誘導(dǎo)更細(xì)微的基因表達(dá)變化來達(dá)成EC阻滯作用:

首先通過在成對(duì)差異分析中比較血管生成和非血管生成的表型來構(gòu)建“正!焙汀澳[瘤血管紊亂”的基因特征,以鑒定差異表達(dá)的基因(經(jīng)校正的p值<0.01,|FC|>1.5)。比較發(fā)現(xiàn)分別有18個(gè)和28個(gè)基因的表達(dá)水平顯著升高,分別處于紊亂(tip,突破和未成熟的EC標(biāo)記基因)和正常(包括毛細(xì)血管標(biāo)記基因)表型中(圖5I,5J,S7D和表S4)。

圖5:I:18個(gè)紊亂基因signature在不同處理組的表達(dá)水平 

J:紊亂基因signature中的基因的表達(dá)水平(黑色虛線左側(cè))和正常的signature(黑色虛線右側(cè))的表達(dá)水平,藥物處理對(duì)這些特征的影響

使用18個(gè)紊亂基因signature的GSVA顯示,腫瘤血管的紊亂被VEGF阻斷部分逆轉(zhuǎn)(圖5I和5J)。

圖S7E-F:藥物影響后的基因改變GSVA分析

兩種VEGFR抑制劑均降低了末端EC基因signature的表達(dá)(糖酵解;BM重塑)

同時(shí)增加了與成熟的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)功能相關(guān)的signature的表達(dá)(抗原呈遞,屏障, 和血管發(fā)育)(圖S7E和S7F)。

因此,VEGF阻斷不僅修剪,而且還調(diào)節(jié)了TECs以促進(jìn)具有穩(wěn)態(tài)功能的更靜態(tài)和成熟的腫瘤脈管系統(tǒng),表明部分腫瘤血管分子正;

6.保守的TEC表型和tip EC標(biāo)記物的鑒定

先前的研究發(fā)現(xiàn),替代性促血管生成信號(hào)的上調(diào)會(huì)使抗VEGF療法的療效受到耐藥性的限制。

為了確定備選的血管生成候選物,作者假設(shè)跨物種和模型保守的TEC表型以及一致表達(dá)的基因可能是更穩(wěn)定的血管生成候選物。

因此,作者進(jìn)行了整合的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué),本體多組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)薈萃分析,以識(shí)別此類候選基因(圖S8A)。

圖S8A:整合分析流程

作者使用scRNA-seq數(shù)據(jù)來評(píng)估跨物種和模型的血管生成EC表型的相似性,使用標(biāo)記基因集的成對(duì)Jaccard相似系數(shù)并應(yīng)用主成分分析(PCA)進(jìn)行可視化(圖6A和S8A)。

圖6A:針對(duì)跨物種的EC主成分分析

在體外,hcTECs失去了體內(nèi)動(dòng)脈,毛細(xì)血管和靜脈的表型。體內(nèi)hTECs和mTECs和末端EC轉(zhuǎn)錄組signature在培養(yǎng)的hcTEC中是保守的。

僅在培養(yǎng)的和小鼠的TEC以及某些NSCLC患者的hTEC中檢測(cè)到具有增殖特征的EC。

新鮮分離的人靜脈和鼠類未成熟TECs,以及中間的hcTECs高度表達(dá)核糖體基因,提示可塑性表型,并過渡到其他血管生成EC表型。

除了tip TEC ,其他表型都是模型或物種特異性的。由于tip TEC在所有測(cè)試的物種和模型中均表達(dá)了相似的標(biāo)記基因標(biāo)記,因此作者著重于確定一致的tip TEC標(biāo)記。

為了構(gòu)建tip TEC標(biāo)記的排名列表,作者首先選擇了296個(gè)保守的tip EC中富集的基因,這些基因在物種和模型的tip TEC中始終表達(dá)最高。

其次,對(duì)于每個(gè)保守基因,作者通過計(jì)算3個(gè)數(shù)據(jù)集中的每個(gè)標(biāo)記基因等級(jí)的乘積來定義等級(jí)得分(在此列表中,始終在tip EC中上調(diào)最高的基因中的基因排名最高)(圖 6B)。

圖6B:保守的tip EC標(biāo)記基因的一致性得分條形圖 

上圖:按指示的生物學(xué)過程分類的50個(gè)排名最高的標(biāo)記基因 

下圖:它們與基準(zhǔn)數(shù)據(jù)集的交集

作者提取了在排名前50位的富集signature進(jìn)行后續(xù)分析。

這些富集的signature包含了先前在tipEC中檢測(cè)到的tip EC標(biāo)記(ANGPT2,APLN,F(xiàn)SCN1,PGF,PLXND1,ADM,PDGFB,CXCR4等),但不一定在表達(dá)模式和功能水平上進(jìn)一步表征。

50個(gè)排名最高的基因中有一半以前沒有被描述為tip TEC標(biāo)記(在腫瘤或生理性血管生成中EC的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中未檢測(cè)到)。

一致的末端TEC標(biāo)記與遷移的末端EC表型相關(guān),包括層粘連蛋白(LAMA4,LAMC1,LAMB1),基質(zhì)細(xì)胞蛋白(SPARC,LXN),細(xì)胞骨架相關(guān)基因(VIM,MARCKS,MYH9,MYO1B)和細(xì)胞粘附分子(CD93,  MCAM,ITGA5)。

確定了新的tip TEC豐富的轉(zhuǎn)錄因子(TCF4,SOX4,SMAD1)。

腫瘤中紊亂的血管結(jié)構(gòu)阻礙了tipTEC的形態(tài)學(xué)鑒定:圖S6J(見上)顯示了tip EC標(biāo)記物的異質(zhì)表達(dá),但標(biāo)志物在腫瘤血管發(fā)芽的最前端及其在形態(tài)學(xué)tip EC中的表達(dá)不能被明確鑒定。

因此,作者使用了產(chǎn)后視網(wǎng)膜血管生成模型來驗(yàn)證LXN(Latexin)和FSCN1(Fascin)在血管前端的tipEC中的表達(dá)(圖S8B)。為了證明其功能作用,作者研究了沉默這些tip細(xì)胞標(biāo)記是否會(huì)影響tip細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)能力。

圖S8B:出生后第5天,固定物異凝集素B4染色指示脈管系統(tǒng)及LXN或FSCN1的免疫染色

作者沉默了人臍靜脈EC(HUVEC;> 70%–80%的沉默效率;圖S8C)中的LXN( [shRNA]敲低)或FSCN1(siRNA沉默)表達(dá),并生成了包含1:1對(duì)照野生型HUVEC(紅色)、FSCN1(綠色)和被LXN沉默的HUVEC混合物的鑲嵌球體。沉默的細(xì)胞很少出現(xiàn)在尖端位置,這證實(shí)了這些標(biāo)記物在tip EC中的作用(圖6C和6D)。

圖6C-D:C:LXNKD D:FSCN1 

照片:EC橢球的代表性顯微照片 右:對(duì)具有指定基因型的tip細(xì)胞的分?jǐn)?shù)進(jìn)行定量7.綜合分析強(qiáng)調(diào)膠原蛋白修飾參與血管生成的作用

編碼膠原蛋白(COL4A1,COL4A2,COL18A1)的基因在最一致的tip EC標(biāo)記中排名前10位,而其他膠原蛋白修飾(交聯(lián))酶(PXDN,PLOD1)則排名前50位(圖6B,見上)。

對(duì)13名獨(dú)立的NSCLC患者進(jìn)行bulk RNAseq和驗(yàn)證性RT-PCR分析表明, TECs中參與膠原蛋白交聯(lián)及羥化水平的基因(LOXL2PLOD1-3)表達(dá)高于NECs(圖6E和6F)。

圖6E-F:通過(E)bulk-RNAseq或(F)qRT-PCR的編碼膠原羥基化和交聯(lián)酶的基因的表達(dá)水平

為了探討其他腫瘤類型的TECs中膠原修飾酶是否上調(diào),作者對(duì)來自五種癌癥患者的bulk RNAseq公開數(shù)據(jù)集中的NEC與TEC進(jìn)行了整合分析。

在此分析中,編碼膠原蛋白修飾酶的轉(zhuǎn)錄物同樣被富集(對(duì)于所有基因,p <0.05),并排在TEC中最一致上調(diào)的基因的前1%–5%之間(圖6G)。

圖6G:排位與富集得分圖

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