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通過整合基因組分析以鑒定肺腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞異質(zhì)性和血管生成候選物

2021-01-07 11:35
科研菌
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附圖3:NSCLC樣品中EC細(xì)胞的RNA原位雜交結(jié)果

作者使用飛行時(shí)間質(zhì)譜分析(CyTOF),使用針對(duì)這些細(xì)胞的26種預(yù)選標(biāo)記的金屬結(jié)合抗體,對(duì)從NSCLC樣品中新鮮分離的單個(gè)的癌癥、EC和基質(zhì)細(xì)胞中的標(biāo)記基因的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行了定量。

圖3I-K:I:CyTOF數(shù)據(jù)的t-SNE圖,以不同顏色區(qū)分基質(zhì)和癌細(xì)胞表型 

J:通過CyTOF在基質(zhì)細(xì)胞亞群中定量HLA-II表達(dá) 

K:通過scRNA-seq和CyTOF分析鑒定的EC表型的層次聚類 CyTOF識(shí)別的簇以藍(lán)色表示。

圖S4:A-B:根據(jù)CyTOF數(shù)據(jù)進(jìn)行t-SNE后細(xì)胞的來源情況展示 

C-D:t-SNE中不同標(biāo)記蛋白的表達(dá) 

E:EC表型指示標(biāo)記蛋白的表達(dá)水平條形圖 

F:hTECs和hPNECs中指示標(biāo)記蛋白表達(dá)水平條形圖

CyTOF單細(xì)胞數(shù)據(jù)的無偏聚類和t-SNE可視化揭示了EC,基質(zhì)和癌細(xì)胞的獨(dú)立簇(圖3I和S4A–S4D)

與scRNA-seq一致,作者檢測(cè)到I型(vWF-low)和II型(vWF-h(huán)igh)肺泡毛細(xì)血管EC,毛細(xì)血管后靜脈EC(ACKR1-h(huán)igh / vWF-h(huán)igh)以及淋巴hPNEC和hTEC表型(PROX1-h(huán)igh)(圖S4E)。

表達(dá)最高CXCR4(tip EC標(biāo)記)水平但下調(diào)毛細(xì)血管標(biāo)志物(CD36,CA4,HLA-II蛋白)的表型可能代表血管生成性hTEC。

檢測(cè)到一個(gè)較弱的簇,作者將其認(rèn)定為假定的活化毛細(xì)血管:與I型和II型毛細(xì)管相比,其毛細(xì)血管標(biāo)志物(CA4,CD36,HLA-II)表達(dá)降低,但靜脈TEC標(biāo)志物vWF和tiphTEC標(biāo)志物水平升高 CXCR4(圖3J和S4E)。

CyTOF證實(shí)了毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中HLA和CD36的水平升高,并在hTECs中被下調(diào)(圖3J和S4F)。

為了驗(yàn)證使用scRNA-seq和CyTOF鑒定出的種群一致的觀察結(jié)果,作者使用關(guān)鍵表面標(biāo)記物(STAR方法)進(jìn)行了層次聚類(圖3K)。

LEC和毛細(xì)管EC聚集在一起,靜脈EC與血管生成EC聚集在一起。

值得注意的是,多尺度自舉分析表明,scRNA-seq解析的I型和II型毛細(xì)管EC最類似于其CyTOF對(duì)應(yīng)物,這一結(jié)果在mRNA和蛋白質(zhì)水平上交叉驗(yàn)證了2種不同的毛細(xì)血管表型的存在。

2.EC表型異質(zhì)性可能的臨床意義

盡管所有患者均未接受過早期治療,作者仍在不同EC表型的相對(duì)分?jǐn)?shù)中觀察到了患者間異質(zhì)性(圖4A)。

在hPNEC中,檢出的動(dòng)脈,毛細(xì)血管,靜脈和淋巴EC的比例各不相同,尤其是毛細(xì)hPNEC表型。

在hTECs中,毛細(xì)血管EC的數(shù)量減少了,這一結(jié)果已通過免疫組織化學(xué)證實(shí)(圖4B), 盡管每個(gè)患者的程度不同。

腺癌中不成熟的hTECs較鱗狀細(xì)胞癌更為豐富。

圖4:A:患者間EC表型的分布情況 

B:以CD31和CD36免疫染色的人腫瘤周圍組織(上)和NSCLC腫瘤(下)照片及定量

為了將EC表型特異性基因標(biāo)記的表達(dá)與NSCLC患者生存相關(guān)聯(lián),作者利用了癌癥基因組圖譜(TCGA)的1,024個(gè)NSCLC患者的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集。利用公開資源(STAR方法)為每種表型鑒定EC特異性標(biāo)記基因集后,作者使用基因集變異分析(GSVA)對(duì)1,024個(gè)中的每個(gè)標(biāo)記的富集程度進(jìn)行NSCLC患者評(píng)分,并分組進(jìn)行生存分析。

鱗狀(但未見腺癌)的NSCLC患者中擁有表達(dá)高水平的血管生成tipEC,

未成熟,活化的毛細(xì)血管后EC或淋巴TECs基因組特征的部分,這些患者總生存期較短,可能是因?yàn)檫@些特征反映了活躍的血管生成和淋巴瘤傳播(圖4C)。

圖4C:對(duì)于TCGA來源數(shù)據(jù)使用GSVA根據(jù)EC表型分組后生存分析結(jié)果3.其他物種和模型中的肺腫瘤EC表型

為了比較跨物種的肺TEC分類法和模型,以在整合一致性分析中識(shí)別常見的血管生成TEC表型和靶標(biāo),作者使用了與人類來源相似的分析策略來構(gòu)建了另外2種肺TEC分類法,主要研究了兩種模型中的TEC情況

顯微分離的29,007個(gè)小鼠mNEC和mTEC,其中存在是否接受過抗VEGF治療的分型

來自人肺腫瘤的6,512個(gè)培養(yǎng)的hcTEC。

這兩者均來自于LLC模型,因?yàn)樗蕾囉谘苌裳苊妊浚ˋAT的靶標(biāo)),這與其他臨床前小鼠NSCLC腫瘤模型不同。

與在人肺中一樣,作者鑒定了富集到的mNEC的表型,這些表型分別表達(dá)動(dòng)脈(M1),I型和II型肺泡毛細(xì)血管(M2,M3),靜脈(M4)和淋巴性(M5)EC的典型標(biāo)志物(圖5A-5D和S5A  –S5G)。

圖5:A:小鼠模型實(shí)驗(yàn)流程 B:不同來源的EC在t-SNE分布情況 

C:整合后的t-SNE圖(對(duì)不同亞群進(jìn)行顏色注釋) 

D:t-SNE聚類后的亞群標(biāo)記基因的表達(dá)分布情況

圖S5:A:mTECs和mNECs中EC表型的相對(duì)豐度。 

BC:標(biāo)記基因在不同亞組中的表達(dá)熱圖 

D:所有已鑒定的mNEC和mTEC表型的不同基因表達(dá)譜的相關(guān)性熱圖 

E:在hTECs和hpNECs不同EC亞型的占比 

F:hTEC和hpNEC對(duì)不同亞型的貢獻(xiàn)情況

圖S5:G:在患者標(biāo)本中對(duì)于所有細(xì)胞的聚類結(jié)果 

H:mNEC和mTEC的t-SNE圖(H2-Aa和H2-Ab基因的) 

在鼠肺EC表型中所示的常駐內(nèi)皮干細(xì)胞(ESC)標(biāo)志物表達(dá)水平的熱圖。 

J-K:Glycam1基因或HEV標(biāo)記基因集的顏色編碼的mNEC和mTEC的t-SNE圖

II型肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)參與MHC-II抗原呈遞,加工和負(fù)載的基因水平最高(圖S5B和S5H),但不表達(dá)共刺激基因Cd80和Cd86。

與NSCLC一樣,在腫瘤中毛細(xì)血管EC的比例不足(圖S5A;表S3),mTEC中典型的毛細(xì)血管基因特征表達(dá)下調(diào),包括MHC-II表達(dá)(圖S5H)。

除了一個(gè)毛細(xì)血管TEC表型(M6)外,mTECs下調(diào)了Cd36(一種涉及脂肪酸攝取的基因)(圖5D)

與人肺不同,鼠肺中的靜脈EC表型表達(dá)了先前在大型肺血管中發(fā)現(xiàn)的常駐內(nèi)皮干細(xì)胞標(biāo)志物(Cd200, Bst1)(圖S5I)。

檢測(cè)到增殖的(M7)和tip的(M8)mTEC(圖5C和5E)。鼠肺中增殖的mTECs比人肺腫瘤中的豐富,這與鼠肺腫瘤的更快生長(zhǎng)以及NSCLC中可能的不同類型腫瘤血管形成相一致(圖5D和S5E)。

檢測(cè)到不成熟的mTEC表型(M9)(圖5C)。

與人類EC一致,觀察到高靜脈可塑性并檢測(cè)到TEC豐富的表型,包括大靜脈EC(M10)和毛細(xì)血管后靜脈EC(M11)(圖5C)。

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