今天，我們非常有幸邀請(qǐng)到丹麥Ferring Pharmaceuticals擔(dān)任首席科學(xué)家楊翼博士在“肽研社”公眾號(hào)平臺(tái)進(jìn)行分享。

楊翼博士

德國(guó)比勒菲爾德大學(xué)博士

Ferring Pharmaceuticals

首席科學(xué)家

楊翼博士于2008年在德國(guó)比勒菲爾德大學(xué)獲得博士學(xué)位，并于同年加入位于瑞士 Visp的LONZA AG，從事多肽原料藥的工藝開發(fā)與GMP生產(chǎn)。楊翼博士如今在丹麥Ferring Pharmaceuticals擔(dān)任首席科學(xué)家，負(fù)責(zé)公司多肽藥物的項(xiàng)目管理、工藝研發(fā)、優(yōu)化、驗(yàn)證、GMP生產(chǎn)監(jiān)督，以及Lean Six Sigma項(xiàng)目。

楊翼博士擁有豐富的多肽工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，在多肽藥物合成路線設(shè)計(jì)、QbD指導(dǎo)的生產(chǎn)工藝開發(fā)、優(yōu)化和驗(yàn)證、多肽副反應(yīng)與雜質(zhì)研究，PGI （潛在基因毒性雜質(zhì)） 管理、多肽藥物GMP生產(chǎn)與項(xiàng)目管理，多肽化學(xué)創(chuàng)新等領(lǐng)域有頗多建樹，多次在國(guó)際會(huì)議上做關(guān)于多肽化學(xué)與多肽GMP生產(chǎn)的學(xué)術(shù)報(bào)告。楊翼博士擁有Lean Six Sigma黑帶認(rèn)證。

楊翼博士撰寫，由Elsevier出版社出版的Side Reactions in Peptide Synthesis（多肽合成副反應(yīng)）一書是多肽化學(xué)領(lǐng)域第一本系統(tǒng)性論述多肽合成副反應(yīng)的專著，廣受行業(yè)贊譽(yù)。目前楊翼博士正在準(zhǔn)備另一本關(guān)于多肽化學(xué)不穩(wěn)定性和降解的學(xué)術(shù)專著，有望成為多肽藥物分子設(shè)計(jì)、多肽化學(xué)生產(chǎn)以及多肽藥物制劑領(lǐng)域的指導(dǎo)。

前     言

自從2018年纈沙坦類藥物因二甲基亞硝胺雜質(zhì)超標(biāo)被召回后，亞硝胺這個(gè)潛在致癌物再次成為制藥業(yè)頭頂上的達(dá)摩克利斯之劍，威脅著藥品的質(zhì)量與患者的安全。

亞硝胺指的是包含R1R2N－N＝O結(jié)構(gòu)的化合物，其中R1， R2通常為烷基。亞硝胺的遺傳毒性和致癌潛力早在50多年前便浮出水面。2020 年 9 月，F(xiàn)DA 發(fā)布了制藥行業(yè)關(guān)于控制藥品中亞硝胺雜質(zhì)的指南。FDA 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，由于存在一定水平的可能致癌物亞硝胺雜質(zhì)（超過 26．5 ng／天的可接受攝入量限制），在過去的兩年內(nèi)已從市場(chǎng)召回超過 1400 批產(chǎn)品。召回產(chǎn)品中存在的藥物包括纈沙坦、厄貝沙坦、氯沙坦、二甲雙胍、雷尼替丁和尼扎替丁 （圖1）。

圖1．部分因亞硝胺雜質(zhì)被召回的藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)式

何亞硝胺的遺傳毒性和致癌性

亞硝胺類化合物屬于“關(guān)注類”高誘變致癌物，該類物質(zhì)已被世衛(wèi)組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)IARC歸入可能是人類致癌物類別。大多數(shù)亞硝胺對(duì)于非人類動(dòng)物都是致癌物。

美國(guó)藥品研究與制造商協(xié)會(huì) （PhRMA） 根據(jù)化合物與DNA反應(yīng)的活性，將所研究的化合物分為三類，即I類、II類和III類。含有 N－羥基、N－�；�的芳香胺類化合物和 N－氧化物的芳香胺屬于 I 類。II 類物質(zhì)包括醛、羥烷基胺、N－亞硝胺，硝基化合物、氮丙啶、環(huán)氧化物、丙內(nèi)酯、丙磺內(nèi)酯、氨基甲酸酯、肼和偶氮化合物。III類物質(zhì)包括邁克爾加成反應(yīng)的受體、膦酸酯、磺酸酯、鹵代烷、鹵代烯烴和烷基／芳基鹵化物 （圖2）。在該分類中，亞硝胺被分在II類，說(shuō)明其具備相當(dāng)?shù)腄NA的反應(yīng)活性。

圖2． 根據(jù)與DNA反應(yīng)活性的化合物分類。

（圖片來(lái)源：Journal of Medicinal Chemistry）

根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)對(duì)各種致癌物致癌性的研究，他們將亞硝胺物質(zhì)按照人類致癌性標(biāo)準(zhǔn)分為四組。第 1 類亞硝胺具有“對(duì)人類致癌”的充分證據(jù) （NNN 與 NNK）。2A 類亞硝胺“可能 （probably） 對(duì)人類致癌”，因其針對(duì)人類致癌性的數(shù)據(jù)有限，但在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上有足夠的證據(jù)。2B 類亞硝胺“或許（possibly）對(duì)人類致癌”，在人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中獲取的證據(jù)都比較有限。剩下的數(shù)據(jù)不足的亞硝胺化合物，則被歸為第3類“不能歸類為人類致癌性的物質(zhì)” （圖3）。

圖3． 國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)的亞硝胺致癌性分類。

（圖片來(lái)源：Journal of Medicinal Chemistry）

如同亞硝酸鹽一樣，亞硝胺本身并不直接導(dǎo)致誘變性和致癌性。如圖4所示，攝入體內(nèi)的亞硝胺類物質(zhì)1，在細(xì)胞色素P450（cytochrome P450）的作用下被氧化為α－羥基亞硝胺 2 （此過程需要亞硝胺底物含有Hα，沒有Hα的取代亞硝胺不發(fā)生這個(gè)羥基化過程，因此可能不具誘變性及致癌性）。后者通常不穩(wěn)定，消除一個(gè)醛分子并轉(zhuǎn)化為1－羥基－2－烷基二亞胺3�；�合物3經(jīng)過脫水產(chǎn)生烷基重氮鹽（diazonium）4，這個(gè)不穩(wěn)定的重氮鹽在釋放一分子氮?dú)夂筠D(zhuǎn)化為高活性的碳正離子5。在這個(gè)過程中形成的碳正離子，可以說(shuō)是亞硝胺化合物遺傳毒性和致癌性的直接兇手。由于高度的親電性（NDMA形成的碳正離子為甲基正離子，具有比其它烷基正離子更高的活性），碳正離子5 作為一個(gè)高效的烷基化試劑進(jìn)攻蛋白質(zhì)和DNA上的眾多親核基團(tuán)，產(chǎn)生烷基化的結(jié)果。DNA中電子富集的堿基具有高親核性，因此成為了高親電碳正離子主要的進(jìn)攻目標(biāo)。例如，碳正離子可以親電進(jìn)攻鳥嘌呤Guanine的N7位置（N7G），使之成為烷基化鳥嘌呤，同樣可以進(jìn)攻鳥嘌呤的O6 （O6G）和胸腺嘧啶Thymine的O4（O4T）。這些堿基在遭受了烷基化改性之后，形成了穩(wěn)定的烷基化堿基，從而導(dǎo)致了可能的誘變性和致癌性。除此之外，在亞硝胺生物轉(zhuǎn)化過程種產(chǎn)生的醛，也可能帶來(lái)遺傳毒性或致癌性。比如NDMA釋放的甲醛，被世衛(wèi)組織和美國(guó)衛(wèi)生與公共服務(wù)部認(rèn)定為“人類致癌物”。作為一種已知的交聯(lián)劑，甲醛可以通過亞甲基橋介導(dǎo)堿基對(duì)之間的交聯(lián)反應(yīng)，從而激發(fā)潛在的致癌性。因此，NDMA和其它亞硝胺也因?yàn)槠湔T導(dǎo)的DNA兼濟(jì)烷基化和醛生成， 而被視為“雙重致癌物”。1，2

強(qiáng)效亞硝胺如 NDMA 和 NDEA 的DNA 損傷特異性仍不清楚，但已確定它們會(huì)產(chǎn)生促誘變 O6－烷基鳥嘌呤加合物（即通過添加小烷基如 －CH3 對(duì)鳥嘌呤進(jìn)行修飾），由此誘發(fā)的烷基化鳥嘌呤最常通過 DNA 烷基轉(zhuǎn)移酶 （AGT，也稱為甲基－鳥嘌呤－甲基－轉(zhuǎn)移酶，MGMT） 進(jìn)行脫烷基化修復(fù)。其他亞硝胺如 NDBA、NDELA、NMEA、NNK 和 NNN 也已知會(huì)產(chǎn)生 O6－烷基鳥嘌呤加合物。MGMT酶的活性在人體內(nèi)具有高度差異。一項(xiàng)小型研究表明，人類結(jié)腸黏膜中 MGMT 的活性變差為 6 至 7 倍。在嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系（例如大鼠肝臟）中，與人類細(xì)胞系相比，MGMT 修復(fù)酶是可誘導(dǎo)的。這可能表明大鼠和人類之間在解毒方面的潛在差異，因此以動(dòng)物模型推算亞硝胺對(duì)人的致癌性可能是不準(zhǔn)確的。

圖4． 亞硝胺生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為碳正離子，以及碳正離子修飾DNA的生化過程。

亞硝胺雜質(zhì)產(chǎn)生的根源分析

沙坦類藥物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上最顯著的共同點(diǎn)在于四唑環(huán)。在沙坦類藥物的合成中，四唑的環(huán)化是由有機(jī)腈與疊氮化鈉的環(huán)加成反應(yīng)在高沸點(diǎn)溶劑（如二甲基甲酰胺或者N－甲基吡咯烷酮）中實(shí)現(xiàn)的，反應(yīng)結(jié)束后，過量的疊氮化鈉用亞硝酸鈉淬滅。然而在這個(gè)特過程中使用的二甲基甲酰胺和N－甲基吡咯烷酮中分別含有二甲胺和4－甲氨基丁酸雜質(zhì)（這些雜質(zhì)即可能是這些溶劑的合成原料，也可能是溶劑分子降解的產(chǎn)物）。這些仲胺在疊氮化鈉的淬滅反應(yīng)中與淬滅劑亞硝酸鈉作用，產(chǎn)生了相應(yīng)的亞硝胺NDMA （二甲基亞硝胺） 和NMBA （N－亞硝基－N－甲基－4－氨基丁酸）。這個(gè)過程是沙坦類藥物產(chǎn)生亞硝胺雜質(zhì)的根本原因（圖5）。尤其是考慮到疊氮化鈉淬滅可能是整個(gè)沙坦合成工藝的最后一步，產(chǎn)生的亞硝胺雜質(zhì)污染最終產(chǎn)品的可能性大大增加。吡格列酮案例中二甲基亞硝胺（NDMA）形成的機(jī)理類似于沙坦，不同的是， 亞硝酸鈉與而二甲基甲酰胺并不出現(xiàn)在同一步反應(yīng)中，而是上一步的亞硝酸鈉被部分?jǐn)y帶到二甲基甲酰胺的步驟，從而與二甲胺雜質(zhì)反應(yīng)，形成了亞硝胺雜質(zhì)。

圖5． 四唑環(huán)化，疊氮化鈉淬滅，以及DMF／NMP介導(dǎo)的亞硝胺形成反應(yīng)。

綜合來(lái)看，在藥物生產(chǎn)（包括原料藥與成品藥）中產(chǎn)生亞硝胺雜質(zhì)的可能來(lái)源包括，但不限于以下幾個(gè)方面：

· 在同一步或者不同步的工藝步驟（例如發(fā)生殘留物轉(zhuǎn)移）中，在存在仲胺或叔胺或季銨鹽的情況下使用亞硝酸鈉。

· 在同一步或者不同步的工藝步驟，將亞硝酸鈉與易降解為仲胺或叔胺的試劑、溶劑和催化劑結(jié)合使用（例如二甲基甲酰胺和N－甲基吡咯烷酮中的二甲胺和4－甲氨基丁酸雜質(zhì)／降解物）。

· 在活性藥物成分 （API） 制造過程中使用受污染的原材料。

· 回收材料（例如溶劑）的使用。包括外包第三方的回收原料，而操作方并不清楚待回收原料中的雜質(zhì)組成成分。以及在非專用設(shè)備中進(jìn)行的常規(guī)回收過程。

· 使用由供應(yīng)商提供的受污染的原材料和中間體，這些供應(yīng)商使用的工藝或原材料可能會(huì)形成亞硝胺。而制造商并不清楚這些原材料和中間體的詳細(xì)雜質(zhì)構(gòu)成。

· 由于在同一條生產(chǎn)線上運(yùn)行的不同工藝以及與操作員相關(guān)的錯(cuò)誤導(dǎo)致的交叉污染事件。

· 起始材料、中間體和原料藥的降解過程，包括由固有反應(yīng)性和亞硝酸鈉殘留引起的降解過程（可能在成品要生產(chǎn)過程或儲(chǔ)存期間發(fā)生）。

· 使用某些包裝材料。

多肽類藥物與亞硝胺雜質(zhì)的相關(guān)性

目前尚未有多肽類藥物因?yàn)閬喯醢冯s質(zhì)超標(biāo)而引發(fā)的藥物召回事件。但2018年的沙坦類藥物召回事件，已經(jīng)促使包括FDA和EMA在內(nèi)的眾多藥監(jiān)機(jī)構(gòu)加大了亞硝胺雜質(zhì)形成的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估要求。包括多肽類藥物制造商和CMO都已經(jīng)接受到了各自藥監(jiān)部門的要求，對(duì)其生產(chǎn)工藝形成亞硝胺雜質(zhì)的可能性做出徹底詳盡的調(diào)查分析。

常規(guī)的多肽類藥物固相合成的工藝中并不過多涉及亞硝酸鹽或者亞硝酸酯類的原料。某些使用酰基疊氮法液相合成多肽，或者進(jìn)行多肽片段縮合的工藝會(huì)使用亞硝酸鹽，將酰肼前體 （通常由酯經(jīng)過肼解反應(yīng)制備） ，經(jīng)過氧化亞硝酸化過程轉(zhuǎn)化為�；�疊氮化合物，并與對(duì)應(yīng)的氨基化合物進(jìn)行縮合，完成目標(biāo)酰胺鍵的構(gòu)造（圖6）。3

圖6． �；�疊氮法合成多肽的化學(xué)反應(yīng)。

酰基疊氮曾經(jīng)是多肽合成最初期常用的縮合方法，盡管這種工藝存在反應(yīng)速率慢的內(nèi)在問題，但由于酰基疊氮在與氨基縮合過程中很低的消旋化副反應(yīng)，因此仍然作為一種有效的手段介導(dǎo)易于遭受消旋化的多肽片段縮合反應(yīng)。由于歷史原因，很多早期獲批上市的多肽藥物是通過液相合成的方式生產(chǎn)的，因此至今仍在沿用看上去已經(jīng)有些過時(shí)的酰基疊氮法液相片段縮合工藝。在該工藝中，N－端的片段在通常在液相中制備，因此其C端基團(tuán)通常為酯 （通常是甲酯） 保護(hù)基團(tuán)（以避免液相反應(yīng)中的副反應(yīng)）。在液相合成片段完畢后，利用肼將多肽片段的酯基團(tuán)轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的酰肼，后者再被亞硝酸鹽氧化，得到亞硝基酰肼中間體，并脫水得到�；�疊氮多肽。這個(gè)含有�；�疊氮結(jié)構(gòu)的N端多肽片段，在接下來(lái)的液相片段縮合反應(yīng)中，與C－端片段的Nα進(jìn)行縮合反應(yīng)，制備完整肽鏈（圖7）。

由于在這個(gè)過程中使用了亞硝酸鈉作為反應(yīng)試劑，因此產(chǎn)生亞硝胺雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)極大。因此，對(duì)于含有此類反應(yīng)的多肽合成工藝，需要對(duì)其進(jìn)行徹底的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，必要的時(shí)候應(yīng)該使用已驗(yàn)證的分析手段，對(duì)于中間品，粗品，或者純品進(jìn)行亞硝胺的檢測(cè)。除此之外，也要對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行同樣的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，因?yàn)閬喯跛猁}如果被攜帶到了最終的產(chǎn)品，那么將有可能在接下來(lái)的制劑步驟，甚至產(chǎn)品儲(chǔ)存階段，與藥物分子或者賦形劑，亦或產(chǎn)品中雜質(zhì)的仲胺進(jìn)行反應(yīng)，生成亞硝胺雜質(zhì)。我在審閱制造商的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告中，就發(fā)現(xiàn)了他們只對(duì)亞硝胺的生成、攜帶和清除做了分析評(píng)估，卻完全忽略了亞硝酸鈉的數(shù)據(jù)，這是一個(gè)巨大的漏洞。

圖7． 酯－酰肼－亞硝基酰肼－�；�疊氮轉(zhuǎn)化過程介導(dǎo)的多肽液相縮合反應(yīng)

多肽化學(xué)中另一個(gè)可能與亞硝胺雜質(zhì)牽扯上的物質(zhì)是縮合試劑添加劑oxyma。由于它更好的熱穩(wěn)定性與不易爆炸的特點(diǎn)，oxyma在工業(yè)領(lǐng)域已經(jīng)逐漸取代了傳統(tǒng)的HOBt，成為了默認(rèn)的多肽縮合試劑添加劑，與DIC共同使用介導(dǎo)常規(guī)的氨基酸縮合反應(yīng)。Oxyma的生產(chǎn)工藝中可能使用亞硝酸作為反應(yīng)物（圖8）。對(duì)于那些在上游合成的最后一步為液相反應(yīng)，且使用oxyma作為原料的案例來(lái)說(shuō)，需要注意可能攜帶的亞硝酸（鹽）。通常的oxyma的Certifate of Analysis（CoA）中并不包含亞硝酸或者亞硝酸鹽雜質(zhì)的含量，但隨著監(jiān)管部門對(duì)于藥物亞硝胺控制趨于嚴(yán)格，多肽藥物制造商應(yīng)該獲取oxyma的生產(chǎn)工藝以及包含亞硝酸（鹽）的CoA。

圖8． Oxyma合成路線

整體看來(lái)，常規(guī)的多肽合成，尤其是固相多肽合成，形成亞硝胺雜質(zhì)的可能性極低，因?yàn)樵诜磻?yīng)中并不涉及亞硝化反應(yīng)物。即便產(chǎn)生了痕量亞硝胺或者亞硝酸鹽，也會(huì)在液相色譜純化的步驟被清除。需要注意的是那些使用酰肼制備�；�疊氮的多肽藥物生產(chǎn)工藝，不僅要檢測(cè)亞硝胺的形成與清除，也要監(jiān)控亞硝酸鹽在這個(gè)過程中的轉(zhuǎn)化，清除與殘留。

亞硝胺雜質(zhì)在多肽藥物合成的另一來(lái)源是有機(jī)溶劑。多肽合成的常規(guī)有機(jī)溶劑DMF與NMP中可能含有不同含量的二級(jí)胺雜質(zhì)，也是NDMA與NMBA亞硝胺產(chǎn)生的前體，它們?cè)趤喯趸�試劑的存在下可能產(chǎn)生亞硝胺雜質(zhì)，這也是沙坦類藥物亞硝胺污染事件的根源。除此之外，使用來(lái)源不明的再利用有機(jī)溶劑，其中可能會(huì)含有亞硝胺或者亞硝酸鹽類物質(zhì)，也會(huì)對(duì)多肽藥物合成造成潛在的威脅。

多肽藥物亞硝胺雜質(zhì)應(yīng)對(duì)策略

美國(guó)藥典公約 （USP） 于 2022 年 2 月 28 日，3 月 2 日和 3 月 4 日舉辦了關(guān)于治療性肽和寡核苷酸的年度研討會(huì)，有幾場(chǎng)演講側(cè)重于多肽雜質(zhì)控制策略，亞硝胺雜質(zhì)首當(dāng)其沖地成為了從業(yè)者的關(guān)注點(diǎn)。Bachem在該研討會(huì)中闡述了他們控制多肽藥物生產(chǎn)中亞硝胺產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)的理念。他們認(rèn)為，為了控制制造過程中產(chǎn)生亞硝胺雜質(zhì)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，在工藝開發(fā)過程中需要一種控制策略，以便將亞硝胺形成或污染的潛在原因降至可接受的水平。失效模式和影響分析 （Failure Mode Effect Analysis， FMEA） 是進(jìn)行此類復(fù)雜的多參數(shù)風(fēng)險(xiǎn)分析的理想工具。

FMEA 中的失效模式（Failure Mode）包括：

· 試劑和原料中含有胺結(jié)構(gòu)的物質(zhì) （仲胺與叔胺是產(chǎn)生亞硝胺的反應(yīng)物之一）

· 試劑和原料中亞硝酸鹽污染的風(fēng)險(xiǎn) （亞硝酸鹽是產(chǎn)生亞硝胺的另一反應(yīng)物）

· 試劑、原料、二級(jí)反應(yīng)，或產(chǎn)品接觸表面被直接污染亞硝胺的風(fēng)險(xiǎn)

每個(gè)單獨(dú)產(chǎn)品的 FMEA 均基于 ICH Q9（質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理）和 ICH M7（R1）（致突變雜質(zhì)）條例制定的，其中最終 API 中亞硝胺的風(fēng)險(xiǎn)取決于遞進(jìn)的三個(gè)參數(shù)：

· 失效模式概率 （PRN FM）： 對(duì)應(yīng)以上三種失效模式發(fā)生的可能性

· 失效模式導(dǎo)致亞硝胺生成的概率 （PRN NA）：失效模式一旦產(chǎn)生，其導(dǎo)致亞硝胺產(chǎn)生的可能性

· 生成的亞硝胺被帶入 API的概率（PRN API）： 亞硝胺一旦產(chǎn)生，其無(wú)法被工藝清除而污染最終產(chǎn)品的可能性

每個(gè)失效模式所蘊(yùn)含的嚴(yán)重性通過“嚴(yán)重性系數(shù) Severity Number （SN） ”＝ PRN FM x PRN NA來(lái)表征。而每個(gè)單個(gè)失效模式相關(guān)聯(lián)的風(fēng)險(xiǎn)由“風(fēng)險(xiǎn)系數(shù) Risk Number （RN）” ＝ SN x PRN API 定義，然后根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)的具體數(shù)值，以及人為建立的檔次標(biāo)準(zhǔn)，將每個(gè)失效模式對(duì)應(yīng)的亞硝胺生成進(jìn)一步分類為 （i） 無(wú)風(fēng)險(xiǎn)，（ii） 極低風(fēng)險(xiǎn)，（iii） 低風(fēng)險(xiǎn)，（iv） 中等風(fēng)險(xiǎn)，以及 （v） 高風(fēng)險(xiǎn)，每個(gè)風(fēng)險(xiǎn)都需要采取適當(dāng)?shù)男袆?dòng)。

Bachem 的 FMEA 方法進(jìn)一步建議組建一個(gè) FMEA 小組，其成員包括來(lái)自制造部門的具有評(píng)估產(chǎn)品專業(yè)知識(shí)的 SME、QA 部門的成員和采購(gòu)部門的成員，小組的活動(dòng)是為了：

· 確定每個(gè)設(shè)施的試劑來(lái)源（每個(gè) FMEA 都是特定于產(chǎn)品和制造設(shè)備）。

· 生成特定于產(chǎn)品的材料清單，并獲取制造商關(guān)于材料可能含有亞硝胺、硝酸鹽或其他可疑前體的風(fēng)險(xiǎn)的聲明。

· 審查在現(xiàn)場(chǎng)使用亞硝酸鹽的任何內(nèi)部產(chǎn)品和流程。檢查 EPR 系統(tǒng)中是否存在這些試劑。

· 評(píng)估和判斷固相多肽合成的洗滌工藝以及 HPLC 純化去除亞硝胺雜質(zhì)的潛力，以防止亞硝胺雜質(zhì)進(jìn)入最終 API。

其他降低污染風(fēng)險(xiǎn)的建議包括：

· 定期使用制備型 HPLC 通過早期識(shí)別來(lái)降低亞硝胺殘留進(jìn)入 API 的風(fēng)險(xiǎn)。

· 使用新鮮的試劑和溶劑可以避免回收過程可能帶來(lái)的潛在污染風(fēng)險(xiǎn)。

總結(jié)

自從2018年沙坦類藥物檢測(cè)出亞硝胺雜質(zhì)而引發(fā)大面積藥物召回事件后，各大藥品監(jiān)管部門都明顯提高了對(duì)亞硝胺雜質(zhì)產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估要求，并加大了在此領(lǐng)域的質(zhì)量分析力度。除了含有四唑結(jié)構(gòu)的各類沙坦藥物被召回之外，不含此結(jié)構(gòu)的雷尼替丁、奧芬那君等藥物因?yàn)樗幬锓肿颖旧懋a(chǎn)生的亞硝胺雜質(zhì)（NDSRI，nitrosamine drug substance related impurities）而遭受了藥品召回。EMA與FDA等監(jiān)管部門隨即指定了針對(duì)藥物本身的亞硝胺雜質(zhì)（NDSRI）限額標(biāo)準(zhǔn)（EMA 為每日允許攝入量 18 ng／天， FDA 為26．5 ng／天）。

由于多肽藥物結(jié)構(gòu)以及多肽合成自身的屬性，它們?cè)馐軄喯醢冯s質(zhì)侵?jǐn)_的可能性相對(duì)于小分子較低。這個(gè)評(píng)估從兩個(gè)方面來(lái)看，首先，多肽分子中并不富含二級(jí)胺結(jié)構(gòu)，因此不易產(chǎn)生亞硝胺。例外的情況來(lái)自于N－端的二級(jí)氨基酸（如脯氨酸，Sarcosine等）和烷基化的賴氨酸，但這種情況同上并不多見，因此產(chǎn)生多肽藥物為基質(zhì)的亞硝胺NDSRI雜質(zhì)的可能性不高。其次，由于多肽本身大分子量的特點(diǎn)，即便產(chǎn)生多肽亞硝胺雜質(zhì)，其致癌性致突變的可能性也是極低的，因?yàn)樗鼈冃纬傻奶颊�離子很難與DNA的堿基之間產(chǎn)生有效的修飾反應(yīng)，因此即便形成，也應(yīng)該有很高的每日允許攝入量。

多肽合成需要注意的是那些使用�；�疊氮法液相縮合多肽的工藝，由于使用了亞硝酸鹽作為原料，因此有形成亞硝胺雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)。但由于多肽合成中需要多步分離處理，以及最后的液相色譜純化，因此亞硝胺雜質(zhì)即便形成，最終污染API的可能性 也較低。這種風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可以遵循FMEA的模式進(jìn)行，F(xiàn)DA和EMA是可以接受沒有分析數(shù)據(jù)，但符合科學(xué)邏輯的評(píng)估手段。但對(duì)于那些使用亞硝酸鹽作為原料的多肽生產(chǎn)，還是強(qiáng)烈建議分析數(shù)個(gè)批次（具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）的中間品或／和粗品或／和純品的亞硝胺以及亞硝酸鹽（后者容易遭受忽略）含量，以確認(rèn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的有效性，并以實(shí)際數(shù)據(jù)證明產(chǎn)品質(zhì)量不遭受亞硝酸鹽和亞硝胺雜質(zhì)的影響。

｜ 引用資料

［1］ Wang M， Cheng G， Villalta PW， Hecht SS． Development of liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry methods for analysis of DNA adducts of formaldehyde and their application to rats treated with N－nitrosodimethylamine or 4－（methylnitrosamino）－1－（3－pyridyl）－1－butanone． Chem Res Toxicol． 2007；20 （8）：1141–1148．

［2］ Loeppky RN， Goelzer P． Microsome－mediated oxidation of N－nitrosodiethanolamine （NDELA）， a bident carcinogen． Chem Res Toxicol． 2002；15（4）：457–469．

［3］ Yi－Chao Huang， Ge－Min Fang， Lei Liu， Chemical synthesis of proteins using hydrazide intermediates． National Science Review， 2016， 3， 107–116．

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       原文標(biāo)題 : Yi專欄 | 亞硝胺雜質(zhì)對(duì)多肽藥物生產(chǎn)的影響