關(guān)注小藥說藥，一起成長！

前言

工程化過繼細(xì)胞療法（ACT）的出現(xiàn)改變了血液腫瘤的治療格局，也為實體瘤的治療帶來了希望。然而，細(xì)胞療法在實體瘤中的應(yīng)用受到腫瘤遷移不良、滲透物理屏障和腫瘤主動抑制的影響。因此，將內(nèi)源性或過繼轉(zhuǎn)移的淋巴細(xì)胞精確引導(dǎo)進(jìn)入實體腫瘤腫塊是實現(xiàn)最佳抗腫瘤效果的必要條件，同時也將提高患者的安全性。

傳統(tǒng)療法，包括化療和放療，已被證明可以刺激T細(xì)胞遷移到腫瘤中，以增強治療效果，而放療可以對遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移產(chǎn)生遠(yuǎn)端效應(yīng)。類似地，通過在腫瘤內(nèi)注射病原體相關(guān)分子模式或溶瘤病毒，直接誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)的炎癥事件，刺激腫瘤部位的全身和局部事件，以鼓勵淋巴細(xì)胞遷移和抗原特異性抗腫瘤反應(yīng)。此外，抗原識別本身是遷移的主要刺激因素。

迄今為止，人們已經(jīng)進(jìn)行了許多探索和嘗試，出現(xiàn)了許多策略，這些策略可用于增強實體瘤免疫治療中過繼轉(zhuǎn)移細(xì)胞（包括CAR－NK和CAR－T細(xì)胞）的遷移和滲透。

趨化因子及其受體

趨化因子是一種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的遷移和運輸。趨化梯度對于將效應(yīng)細(xì)胞招募到炎癥部位，包括腫瘤微環(huán)境（TME）至關(guān)重要。實體瘤的趨化因子表達(dá)由基質(zhì)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞分泌，以決定哪些免疫細(xì)胞被招募到TME，從而幫助或阻礙腫瘤生長。

多種趨化因子／趨化因子受體策略已用于免疫治療性T細(xì)胞臨床前研究，以促進(jìn)CAR－T細(xì)胞靶向腫瘤，包括利用CXCR3、CXCR2、CCR5、CCR2和CCR3軸。目前還沒有獲得批準(zhǔn)的癌癥趨化因子免疫治療策略，但多個研究顯示其具有良好的臨床潛力。

CXCR3

CXCR3軸是實體瘤免疫細(xì)胞募集的關(guān)鍵途徑，CXCR3的配體包括CXCL9、CXCL10和CXCL11。激活后，CXCR3在效應(yīng)器TH1極化的CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞上誘導(dǎo)并高表達(dá)，腫瘤中CXCR3配體的表達(dá)、血清CXCR3配體水平的升高以及T細(xì)胞上的CXCR3增強了T細(xì)胞的募集，并在一系列癌癥中獲得了積極的臨床前結(jié)果。

溶瘤痘苗病毒在間皮瘤小鼠模型中對CXCL11的腫瘤局部表達(dá)成功地增加了內(nèi)源性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞向腫瘤的轉(zhuǎn)運，并誘導(dǎo)了系統(tǒng)性抗腫瘤免疫，突出了CXCR3軸對淋巴細(xì)胞遷移的重要性。此外，表觀遺傳調(diào)節(jié)劑（DNA甲基化和H3K27三甲基化抑制劑）的使用恢復(fù)了CXCL9和CXCL10的腫瘤表達(dá)，提高了卵巢癌小鼠模型中的CAR－T細(xì)胞效率，改善了T細(xì)胞浸潤和腫瘤生長控制。在小鼠骨髓瘤模型中，將編碼CXCL10和IL－18的兩種溶瘤腺病毒聯(lián)合注射到已建立的腫瘤中，可導(dǎo)致腫瘤生長變小，80％的小鼠腫瘤完全消退。

CXCR2

在一系列腫瘤模型中，T細(xì)胞上CXCR2表達(dá)的調(diào)節(jié)已被證明能提高治療效果。CXCR2對多種腫瘤上過表達(dá)的配體具有特異性，包括CXCL1、CXCL2、CXCL5和CXCL8。這些配體也由各種浸潤性免疫細(xì)胞表達(dá)，通常被認(rèn)為是促腫瘤趨化因子。例如，CXCL8可直接促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移，并可通過招募粒細(xì)胞源性抑制細(xì)胞和中性粒細(xì)胞來促進(jìn)促轉(zhuǎn)移生態(tài)位。利用促腫瘤細(xì)胞因子表達(dá)的一種策略是在理想的效應(yīng)細(xì)胞上異位表達(dá)其受體，如CXCR2，從而將其靶向腫瘤。

原代T細(xì)胞中CXCR2的表達(dá)增強了黑色素瘤小鼠模型腫瘤中T細(xì)胞的積累，改善了腫瘤的消退和存活。一項正在進(jìn)行的I／II期試驗旨在用CXCR2轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者，隨后進(jìn)行高劑量IL－2治療，目前臨床結(jié)果報告尚未公布（NCT01740557）。CXCR2表達(dá)在CAR－T細(xì)胞治療中也顯示出了應(yīng)用前景。在肝細(xì)胞癌腫瘤模型中，CAR－T細(xì)胞上CXCR2的強制表達(dá)增加了腫瘤內(nèi)的遷移和積聚，改善了治療結(jié)果。類似地，CXCR1或CXCR2的異位表達(dá)增強了向腫瘤的轉(zhuǎn)移，并在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胰腺癌和卵巢癌模型中誘導(dǎo)腫瘤消退并提高了生存率。

CCR4

受體CCR4在CD8＋T細(xì)胞上低表達(dá)，其配體為CCL22和CCL17。在霍奇金淋巴瘤小鼠模型中，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)抗CD30 CAR－T細(xì)胞增強CCR4的表達(dá)，增強了體外向淋巴瘤細(xì)胞的遷移，并提高了CAR－T細(xì)胞治療的效果。盡管這項研究使用了血液癌癥模型，但這種方法也可以應(yīng)用于實體瘤，因為在胃腸道癌、卵巢癌和胰腺癌中發(fā)現(xiàn)了CCL22和／或CCL17表達(dá)上調(diào)。在胰腺癌小鼠模型中，用CCR4對抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，增強了向腫瘤部位的遷移，并消除了40％小鼠的腫瘤。有趣的是，研究表明，CCR4修飾增強了與DC的相互作用，增強了T細(xì)胞LFA－1與DC ICAM－1的結(jié)合。因此，這種策略不僅有可能增強腫瘤的浸潤，還可能增強腫瘤內(nèi)部免疫細(xì)胞的激活和支持。

CCL2

CCL2由一系列腫瘤和支持腫瘤的免疫細(xì)胞分泌，并誘導(dǎo)促腫瘤免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、TH2和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）的遷移。然而，其同源受體CCR2b僅在活化的T細(xì)胞上弱表達(dá)。與不表達(dá)CCR2b的CAR－T細(xì)胞相比，表達(dá)CCR2b的GDH－CAR－T細(xì)胞上向分泌CCL2的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)運增強了10倍，并增加了相對抗腫瘤活性。然而，靶向CCL2途徑可能會產(chǎn)生一些意外的毒性后果，因為CCL2在一系列非腫瘤細(xì)胞類型表達(dá)，包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌和成纖維細(xì)胞，并且與多種疾病有關(guān)，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、炎性腸病和SARS－CoV－2感染�？紤]到腫瘤產(chǎn)生的CCL2水平高于正常組織，CCR2b轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR－T細(xì)胞尚需通過實驗進(jìn)行評估。

CXCR4

趨化因子受體CXCR4廣泛表達(dá)于多種血液腫瘤和實體瘤。其與對應(yīng)配體CXCL12（SDF1）的結(jié)合促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、存活和轉(zhuǎn)移。對CXCR4的抑制導(dǎo)致T細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤增強，同時癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）的募集減少。因此，抑制CXCR4是增強CAR－T和CAR－NK細(xì)胞向腫瘤部位浸潤的潛在策略。

最近的研究表明，聯(lián)合使用抗EGFRvIII CAR－T細(xì)胞和PARP抑制劑olaparib可提高療效。olaparib可減少CAF分泌CXCL12，從而減少MDSC的遷移和浸潤，提高乳腺癌小鼠模型中CAR－T細(xì)胞治療的效果。

CCL5

CCL5由一系列趨化因子受體識別，這些受體表達(dá)在激活的T細(xì)胞上，如CCR1、CCR3和CCR5，使CCL5成為腫瘤特異性表達(dá)的良好候選，以促進(jìn)過繼轉(zhuǎn)移的淋巴細(xì)胞遷移。CCL5武裝的溶瘤病毒和CAR－T細(xì)胞療法已成功用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤小鼠模型。

在NK細(xì)胞治療的臨床前小鼠模型中，利用CCL5軸也被證明能提高療效。注入的NK細(xì)胞被設(shè)計為過表達(dá)CCR5，并在腫瘤內(nèi)注射攜帶CCL5的痘苗病毒，導(dǎo)致NK細(xì)胞浸潤增加和腫瘤消退。

盡管趨化因子的調(diào)節(jié)在免疫治療模型中已顯示出前景，但仍存在嚴(yán)重的應(yīng)用問題，可能會限制其療效。一個重要的考慮因素是，大多數(shù)趨化因子可能存在非特異性招募。例如，盡管CCL5可以通過招募T、NK和DC細(xì)胞等CCR5＋細(xì)胞來增強抗腫瘤免疫反應(yīng)，但它也可以招募單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并促進(jìn)癌癥侵襲。總之，需要明確所選趨化因子的作用，以防止抑制細(xì)胞意外招募到腫瘤中。

溶瘤病毒

溶瘤病毒（OV）具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，有可能與過繼細(xì)胞治療一起用于組合策略。OVs調(diào)節(jié)TME并影響宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力為使用OVs靶向CAR－T細(xì)胞治療腫瘤提供了強有力的理論依據(jù)。在機制上，OVs誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫原性細(xì)胞死亡，釋放損傷和病原體相關(guān)的分子模式（DAMP和PAMP）、腫瘤相關(guān)抗原或新抗原，并在腫瘤部位誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)。OVs可以在腫瘤細(xì)胞上誘導(dǎo)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）的表達(dá)，從而增加抗原呈遞。此外，OV介導(dǎo)的TME重塑影響先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞功能，增強樹突狀細(xì)胞激活、淋巴細(xì)胞浸潤和激活，并刺激表位擴散。

除了OVs的自然免疫調(diào)節(jié)外，它們的基因修飾允許腫瘤局部表達(dá)廣泛的多肽或非編碼RNA，以進(jìn)一步增強腫瘤的炎癥特征，支持免疫細(xì)胞遷移和激活。在一系列臨床前研究中，攜帶一系列細(xì)胞因子、趨化因子和雙特異性T細(xì)胞接合器的OV已被用于重塑TME，并提高了CAR－T細(xì)胞治療效果。TILT－123是一種攜帶TNF－α和IL－2的溶瘤腺病毒，具有與CAR－T細(xì)胞組合策略的潛力。在一系列臨床前模型中與PD－L1抑制顯示出令人信服的協(xié)同作用，TILT－123目前正在招募兩個臨床試驗進(jìn)行臨床研究，作為單藥或與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤（NCT04695327，NCT04217473）。

OV與CAR－T細(xì)胞療法的另一種用途是利用轉(zhuǎn)基因OV誘導(dǎo)腫瘤中的靶抗原表達(dá)。這一原理已在臨床前研究中得到證實， CD19抗原通過OV載體展示在實體腫瘤細(xì)胞表面，從而通過抗CD19 CAR－T細(xì)胞療法實現(xiàn)有效靶向。目前有兩項I期臨床試驗（NCT01953900，NCT03740256），正在測試溶瘤病毒和CAR－T細(xì)胞治療實體瘤的協(xié)同作用。

腫瘤誘導(dǎo)啟動子

除了基因的組成性表達(dá)已被用于增強CAR－T細(xì)胞治療外，還可以通過使用可誘導(dǎo)啟動子系統(tǒng)特異性表達(dá)腫瘤的靶向性基因。通過腫瘤抗原觸發(fā)炎癥介質(zhì)（包括趨化因子）的位點特異性釋放是鼓勵其他CAR－T細(xì)胞和旁觀者細(xì)胞向腫瘤遷移的有用方式。

通過識別腫瘤抗原激活的可誘導(dǎo)啟動子，無論是通過T細(xì)胞或TIL中的CAR或TCR，已被用于過表達(dá)多種基因，尤其是抗腫瘤細(xì)胞因子，并已被證明在提高安全性的同時增強了抗腫瘤效果。

IL－12已被證明能增強體內(nèi)CAR－T細(xì)胞活性，但I(xiàn)L－12的毒性也很明顯。靶向表達(dá)的臨床前測試主要包括基于IL－2的NFAT啟動子，將IL－12表達(dá)靶向腫瘤部位。使用這些抗原觸發(fā)的啟動子將IL－12表達(dá)固定在腫瘤部位，可提高體內(nèi)CAR－T細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用，并減少有效殺傷腫瘤所需的CAR－T細(xì)胞數(shù)量。該策略將IL－12表達(dá)觀察到的全身毒性降至最低。CAR－T細(xì)胞局部表達(dá)IL－12也被證明能激活腫瘤部位的固有免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞，有助于消除抗原陰性的腫瘤細(xì)胞。

NFAT誘導(dǎo)啟動子在非CAR－ACT中也顯示出優(yōu)勢，例如TCR和TIL－ACT。與非工程化TIL相比，在腫瘤部位選擇性表達(dá)IL－12的TIL產(chǎn)生了增強的抗腫瘤免疫反應(yīng)，并且在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的臨床試驗（NCT01236573）中所需劑量降低了10到100倍。雖然觀察到了一些毒性，但它使用的誘導(dǎo)系統(tǒng)在人類治療中展現(xiàn)出了應(yīng)用潛力。

對于非TAA的信號作出反應(yīng)的啟動子的開發(fā)是另一個正在發(fā)展的研究領(lǐng)域，可以利用腫瘤代謝物特征的改變。有研究利用CMV啟動子內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)元件開發(fā)了一種缺氧腫瘤微環(huán)境傳感器�！癏iTA系統(tǒng)”將CAR－T細(xì)胞基因表達(dá)限制在低氧環(huán)境中，而忽略了表達(dá)TAA的常氧組織。缺氧誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)也可用于表達(dá)其他轉(zhuǎn)基因或CAR本身，以聚焦和增強免疫反應(yīng)。

CAR結(jié)構(gòu)的改造

CAR結(jié)構(gòu)的選擇和設(shè)計是優(yōu)化遷移和抗腫瘤活性的關(guān)鍵考量因素。Dual CARs和Universal CARs（UniCAR）等系統(tǒng)是改善CAR－T細(xì)胞腫瘤靶向性和安全性的有效方法。

Dual CAR－T細(xì)胞表達(dá)針對不同抗原的CAR，可以在單個T細(xì)胞上表達(dá)一個以上的CAR或者用兩組不同CAR結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞，以實現(xiàn)對多種抗原的靶向。這些方法已成功應(yīng)用于一系列體內(nèi)實體瘤的臨床治療，在臨床試驗中表現(xiàn)良好的結(jié)果。如通過體內(nèi)靶向CD38和BCMA，組合兩個獨立的CAR－T細(xì)胞在臨床已成功治療多發(fā)性骨髓癌，客觀緩解率達(dá)到87．5％，在隨訪近1年后，有76．9％的患者未出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。另外，針對CD19／CD22的雙靶點CAR－T也進(jìn)入臨床試驗（NCT03233854）。早期結(jié)果顯示，88％的患者都能成功緩解，且全部完全緩解；21名LBCL患者中，62％的患者有反應(yīng)，有29％的患者完全緩解。

UniCAR通過引入第二個組件，稱為靶向模塊（TM），為臨床控制免疫反應(yīng)創(chuàng)造了一個安全“開關(guān)”。TMs是UniCAR－T細(xì)胞靶抗原與TAA結(jié)合域（例如單鏈抗體）的融合蛋白分子，TMs將CAR與TAA連接起來，由于TM半衰期短（15–45分鐘），去除TM可迅速消除UniCAR－T細(xì)胞活性。

目前，幾個UniCAR系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗階段，幾乎所有系統(tǒng)都專注于針對一系列靶點的血液惡性腫瘤，包括CD19（NCT02808442和NCT02746952）、CD22（NCT04150497）和CD123（NCT03190278）。雖然CD19試驗在很大程度上取得了成功，67％的患者獲得了完全緩解，但其他試驗，如CD123 UniCAR試驗（NCT04106076），遇到了安全問題。對于實體瘤，只有少數(shù)UniCAR臨床試驗注冊，如一項針對前列腺癌中的PMSA的臨床試驗（NCT04633148）。

針對腫瘤微環(huán)境

癌相關(guān)成纖維細(xì)胞是一種表型異質(zhì)性細(xì)胞群，可構(gòu)建和重塑TME細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。消耗或改變CAF的功能是目前一個深入研究的領(lǐng)域，有可能成為增強ACT和免疫療法的一個有吸引力的選擇。

由于CAF有助于ECM／細(xì)胞屏障，因此減少其數(shù)量和活性有可能與CAR－T／NK細(xì)胞治療產(chǎn)生協(xié)同作用，以增加淋巴細(xì)胞向腫瘤的遷移。目前已經(jīng)開發(fā)出幾種CAR，它們通過靶向成纖維細(xì)胞活化蛋白α（FAP－α）直接消耗CAF發(fā)揮抗腫瘤作用�？笷AP－α CAR－T細(xì)胞治療已在多種實體瘤的臨床前模型中顯示出令人信服的療效。有兩項利用抗FAP－α CAR－T細(xì)胞的臨床試驗，一項已完成的胸膜間皮瘤1期臨床試驗（NCT01722149）和一項利用第四代CAR的1期臨床試驗（NCT03932565）。

另一種不同的策略是去除免疫抑制細(xì)胞，如MDSC和TAM。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤小鼠模型中，去除腫瘤局部MDSC可提高CAR－T細(xì)胞的療效和腫瘤浸潤。通過使用抗葉酸受體β－CAR－T細(xì)胞清除TAM，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性腫瘤特異性CD8＋T細(xì)胞浸潤增加。TAM靶向CAR－T細(xì)胞預(yù)處理增強了腫瘤特異性抗間皮素CAR－T細(xì)胞的療效，使腫瘤消退并延長生存期。

此外，實體瘤通常表現(xiàn)出代謝紊亂，導(dǎo)致免疫抑制代謝物的釋放，包括乳酸、腺苷和活性氧（ROS），這些代謝物可有效抑制淋巴細(xì)胞遷移。CAR－T／NK細(xì)胞治療與腫瘤代謝抑制劑的聯(lián)合可能增強它們向腫瘤的遷移和對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

增強DC細(xì)胞活性

樹突狀細(xì)胞（DC）有助于T細(xì)胞室的穩(wěn)態(tài)、激活和遷移潛能。在過繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移的同時，使用刺激和增強內(nèi)源性DC活性的策略將使T細(xì)胞參與和激活最大化，鼓勵表位擴散，并以更有利于局部和全身免疫活動的方式改變TME。

Flt3L是動員和擴增DC細(xì)胞的關(guān)鍵生長因子，工程化的CAR－T細(xì)胞分泌Flt3L增加了骨髓和腫瘤中的DC前體細(xì)胞，增加了腫瘤內(nèi)DC分泌IL－12和TNF，并抑制了腫瘤生長。關(guān)鍵的是，CAR－T細(xì)胞分泌Flt3L同時促進(jìn)內(nèi)源性CD8＋T細(xì)胞腫瘤浸潤，并導(dǎo)致表位擴散，表明使用Flt3L激活了宿主DC細(xì)胞，增強了淋巴細(xì)胞向?qū)嶓w瘤的遷移。

小結(jié)

CAR－T和CAR－NK細(xì)胞治療是改善癌癥患者預(yù)后的一種非常有前景的方法。雖然它們對血液系統(tǒng)惡性腫瘤很有效，但克服實體瘤依然困難重重。最近，人們將刺激遷移、改善腫瘤微環(huán)境和去除腫瘤屏障的藥物與基于CAR－T／NK的治療相結(jié)合，以改善CAR－T和NK細(xì)胞在實體瘤令人失望的表現(xiàn)。這些策略將為推進(jìn)針對實體瘤的工程化T細(xì)胞和NK細(xì)胞治療提供關(guān)鍵途徑。

參考文獻(xiàn)：

1．Controlling Cell Trafficking： Addressing Failures in CAR T and NK Cell Therapy of Solid Tumours． Cancers （Basel）． 2022Feb； 14（4）： 978．

       原文標(biāo)題 : 實體瘤CAR-T和CAR-NK細(xì)胞治療腫瘤靶向的解決辦法