前言

在癌癥仍處于局部狀態(tài)的早期檢測(cè)可改善大多數(shù)癌癥類(lèi)型患者對(duì)醫(yī)療干預(yù)的反應(yīng)。宮頸細(xì)胞學(xué)等篩查工具在降低死亡率方面的成功，引發(fā)了人們對(duì)早期檢測(cè)新方法的極大興趣（例如，使用非侵入性血液或生物流體生物標(biāo)記物）。然而，從早期病變中產(chǎn)生的生物標(biāo)志物受到基本的生物和運(yùn)輸障礙的限制，例如循環(huán)時(shí)間短和血液中的稀釋?zhuān)�需要高靈敏度的方法來(lái)檢測(cè)非常低的信號(hào)水平。此外，個(gè)體生物標(biāo)記物通常缺乏特異性，它們?cè)诜前┬詶l件下可能會(huì)升高，或者在多種癌癥中存在，這就需要識(shí)別多種分析物組合以評(píng)估疾病。

這些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)為基于生物工程傳感器（如分子探針或基因編碼載體）設(shè)計(jì)的新興診斷提供了依據(jù)，這些傳感器利用了早期腫瘤或其前體的失調(diào)特征，產(chǎn)生一個(gè)放大的信號(hào)，這些外源性傳感器利用腫瘤依賴(lài)性激活機(jī)制，如酶放大，來(lái)驅(qū)動(dòng)合成生物標(biāo)記物的產(chǎn)生和放大。癌癥也可以通過(guò)成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，這些系統(tǒng)可能具有合成生物標(biāo)記物方法的基本特征，例如報(bào)告基因成像。這些新興的技術(shù)推動(dòng)了早期癌癥檢測(cè)的發(fā)展，合成生物標(biāo)志物可能成為未來(lái)的早期癌癥檢測(cè)方法。

早期癌癥發(fā)現(xiàn)的挑戰(zhàn)

早期癌癥檢測(cè)對(duì)于持續(xù)脫落的生物標(biāo)記物，如蛋白質(zhì)，患者腫瘤的生物標(biāo)記物并非普遍呈陽(yáng)性，即使對(duì)于相同腫瘤類(lèi)型的細(xì)胞，分泌率也可能變化多達(dá)四個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，由死亡細(xì)胞釋放的生物標(biāo)記物只會(huì)脫落一次，它們的檢測(cè)與健康組織的背景脫落很容易混淆。例如，細(xì)胞游離DNA（cfDNA）是從全身非癌細(xì)胞中釋放出來(lái)的，這使得惡性細(xì)胞與正常細(xì)胞的體細(xì)胞突變比例或變異等位基因頻率（VAF）在低腫瘤負(fù)荷下越來(lái)越難以檢測(cè)。

通過(guò)治療追蹤非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展研究的分析預(yù)測(cè)，1、10或100cm3的原發(fā)腫瘤負(fù)荷將導(dǎo)致平均血漿VAF分別為0．006％、0．1％或1．3％。對(duì)于典型的4毫升血漿，據(jù)估計(jì)，每管平均只有6個(gè)分子攜帶相應(yīng)的體細(xì)胞突變。進(jìn)一步加劇技術(shù)挑戰(zhàn)的是，生物標(biāo)記物被大量血液稀釋?zhuān)瑢?dǎo)致在循環(huán)中被降解或清除，例如，ctDNA在血液中的循環(huán)半衰期不到1．5小時(shí)。

雖然，基于數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)和基因組時(shí)間線(xiàn)研究一致估計(jì)了至少十年的早期癌癥檢測(cè)機(jī)會(huì)窗口。但是，快速生長(zhǎng)和高度侵襲性的癌癥，可能會(huì)在幾個(gè)月到幾年的相對(duì)狹窄窗口內(nèi)迅速進(jìn)展，并與較差的臨床結(jié)果相關(guān)。例如三陰性乳腺癌和高度漿液性卵巢癌（HGSOC），其腫瘤具有BRCA1或BRCA2突變，或同源重組缺陷。合成生物標(biāo)志物研究領(lǐng)域的進(jìn)展旨在應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，主要方法是利用基于活性或基因編碼的機(jī)制進(jìn)行早期檢測(cè)。

基于活性分子的合成生物標(biāo)志物

用外源性藥物全身給藥來(lái)評(píng)估體內(nèi)生物功能有著悠久的臨床歷史�；�于活性的合成生物標(biāo)記物就基于這種模式，包括由腫瘤或其微環(huán)境中的酶激活的傳感器和小分子探針，以提供腫瘤生物標(biāo)記物的分子放大機(jī)制。

蛋白酶激活的合成生物標(biāo)記物

蛋白酶激活的合成生物標(biāo)記物包括結(jié)合到惰性載體表面的肽底物，該載體在被腫瘤蛋白酶酶切后釋放報(bào)告物到血液或尿液中進(jìn)行檢測(cè)。除了分子信號(hào)放大之外，達(dá)到早期檢測(cè)所需檢測(cè)限（LOD）的另一個(gè)關(guān)鍵策略是利用人體生理學(xué)特征來(lái)增加生物流體中的合成生物標(biāo)記物濃度。一種方法是通過(guò)選擇流體動(dòng)力學(xué)半徑大于腎小球?yàn)V過(guò)屏障（～5nm）的載體，利用腎臟的大小過(guò)濾，以防止表面結(jié)合肽被清除到尿液中。

另一個(gè)關(guān)鍵策略是加強(qiáng)被動(dòng)遞送到腫瘤部位。例如使用聚乙二醇（PEG）聚合物加氧化鐵納米顆粒（IONPs）具有更高的被動(dòng)擴(kuò)散速率，可以增加對(duì)腫瘤的輸送。另一種方法是利用腫瘤穿透配體使傳感器功能化，這些配體參與到腫瘤微環(huán)境的活躍運(yùn)輸途徑。

蛋白酶是一種混合酶，能夠切割多種底物序列，這限制了單個(gè)傳感器的檢測(cè)特異性。因此，另一個(gè)關(guān)鍵設(shè)計(jì)原則是設(shè)計(jì)一個(gè)多傳感器庫(kù)，通過(guò)特征分析檢測(cè)癌癥。這種方法要求傳感器庫(kù)中的每個(gè)合成生物標(biāo)記物都用獨(dú)特的分子進(jìn)行標(biāo)記。

小分子探針

鑒于越來(lái)越多的腫瘤特異性抗原、細(xì)胞表面標(biāo)記物和代謝途徑可作為小分子的靶點(diǎn)，一些研究重點(diǎn)放在工程化分子探針，以生成用于癌癥檢測(cè)的合成生物標(biāo)記物。

30多年來(lái)，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的小分子被廣泛用作研究實(shí)驗(yàn)室的診斷探針。穩(wěn)定同位素標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)包括：對(duì)患者沒(méi)有輻射風(fēng)險(xiǎn)，與未經(jīng)修飾的對(duì)應(yīng)物相比代謝沒(méi)有差別，以及高信噪比。FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了幾種同位素標(biāo)記探針，包括13C－methacetin和13C－cholate，它們分別測(cè)量肝細(xì)胞色素P450活性和肝分流，用于測(cè)量肝纖維化背景下的肝功能障礙，肝纖維化是肝細(xì)胞癌的一個(gè)重要風(fēng)險(xiǎn)因素。

患者呼吸樣本中存在的天然揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）也已用于癌癥診斷。Lang等人使用了一種同位素標(biāo)記的合成VOC，稱(chēng)為“D5乙基－β－D－葡糖苷酸”（EtGlu），它是乙醇的氘化代謝物。靜脈注射后，EtGlu通過(guò)β－葡萄糖醛酸酶（一種由實(shí)體瘤分泌的胞外酶）酶轉(zhuǎn)化為D5乙醇，然后通過(guò)氣相色譜結(jié)合高分辨率質(zhì)譜從呼吸中檢測(cè)。

基因編碼的合成生物標(biāo)志物

哺乳動(dòng)物合成生物學(xué)的進(jìn)步正在推動(dòng)生物傳感的發(fā)展。除了基于活性的探針外，基因編碼的結(jié)構(gòu)還形成了另一組主要策略，使用工程組件或細(xì)胞來(lái)放大合成生物標(biāo)記物的釋放。這些方法側(cè)重于驅(qū)動(dòng)腫瘤微環(huán)境中的常駐細(xì)胞或浸潤(rùn)細(xì)胞產(chǎn)生或分泌生物正交報(bào)告物的策略。這些方法的主要優(yōu)點(diǎn)是能夠?qū)⒑铣缮�物�?biāo)記物的產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄到特定表型的細(xì)胞，從而潛在地減少健康組織中由背景產(chǎn)生引起的假陽(yáng)性數(shù)量。目前，有三大類(lèi)用于產(chǎn)生合成生物標(biāo)記物的基因編碼系統(tǒng)，包括基于載體的系統(tǒng)、基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的系統(tǒng)和基于細(xì)菌細(xì)胞的系統(tǒng)。

基于載體的合成生物標(biāo)記物

基于載體的系統(tǒng)依賴(lài)于兩個(gè)關(guān)鍵設(shè)計(jì)組件：一個(gè)組織選擇性或癌癥選擇性啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄，一個(gè)合成生物標(biāo)記物被設(shè)計(jì)成分泌到血液或尿液中用于檢測(cè)。組織選擇性啟動(dòng)子提供了第一水平的特異性，例如正常沉默的人類(lèi)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）的啟動(dòng)子，它編碼端粒酶，端粒酶在癌細(xì)胞中經(jīng)常被激活以實(shí)現(xiàn)增殖永生，這是癌癥的標(biāo)志之一。由于TERT在約90％的人類(lèi)癌癥中高水平表達(dá)，但在幾乎所有的體細(xì)胞中都被沉默，因此TERT啟動(dòng)子已被用于驅(qū)動(dòng)多種腫瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)。

基于載體策略的第二個(gè)組成部分是作為合成生物標(biāo)記物的分泌報(bào)告物，可以在血液或尿液中檢測(cè)到。分泌型胚胎堿性磷酸酶（SEAP）是第一批被設(shè)計(jì)用于體內(nèi)應(yīng)用的報(bào)告物之一。SEAP是人類(lèi)胎盤(pán)堿性磷酸酶的一種工程形式，在膜錨定結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)終止密碼子，將其轉(zhuǎn)化為一個(gè)截短但完全活躍的分泌型報(bào)告物。在異種移植腫瘤模型中，SEAP水平與腫瘤大小和細(xì)胞數(shù)量直接相關(guān)。另一個(gè)常用的報(bào)告物是熒光素酶。

基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的合成生物標(biāo)記物

最近過(guò)繼細(xì)胞療法的臨床成功激發(fā)了工程化哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為活體生物傳感器的嘗試。細(xì)胞作為診斷載體的一個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)是，與分子探針相比，一些細(xì)胞能夠定位并浸潤(rùn)癌癥部位，而分子探針依賴(lài)于血管系統(tǒng)的被動(dòng)擴(kuò)散來(lái)積聚在腫瘤中，因此受到限制。

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是具有再生和免疫調(diào)節(jié)特性的成年多能干細(xì)胞，Liu等人使用小鼠模型證明了工程化MSC可用于檢測(cè)血液中的癌癥轉(zhuǎn)移。首先，MSCs被設(shè)計(jì)成分泌人源化谷氨酸，靜脈注射后，與無(wú)腫瘤小鼠相比，乳腺癌肺轉(zhuǎn)移小鼠體內(nèi)的工程化MSC持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，導(dǎo)致人源化Gluc的血液水平更高。然而，由于MSCs對(duì)炎癥和損傷部位表現(xiàn)出趨化性，或自身可能參與癌癥進(jìn)展，因此需要更多的研究來(lái)了解這些潛在的局限性。

Aalipour等人進(jìn)一步發(fā)展了基于細(xì)胞的診斷概念，使用工程化巨噬細(xì)胞作為活細(xì)胞傳感器。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2型重編程導(dǎo)致精氨酸酶1（由ARG1編碼）水平發(fā)生顯著變化，而在實(shí)體瘤中過(guò)繼轉(zhuǎn)移的巨噬細(xì)胞可將精氨酸酶1上調(diào)多達(dá)200倍�；�于這一發(fā)現(xiàn)，他們使用ARG1啟動(dòng)子在巨噬細(xì)胞M2極化時(shí)驅(qū)動(dòng)谷氨酸的產(chǎn)生。這項(xiàng)研究為細(xì)胞免疫診斷的概念奠定了基礎(chǔ)，考慮到許多其他免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中同樣調(diào)節(jié)代謝基因的表達(dá)，這種方法也可以擴(kuò)展到T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。

基于細(xì)菌的合成生物標(biāo)記物

某些類(lèi)型的細(xì)菌滲透并選擇性地在腫瘤中生長(zhǎng)，這歸因于抑制免疫監(jiān)視和實(shí)體瘤核心內(nèi)壞死細(xì)胞釋放的營(yíng)養(yǎng)素水平增加。這促使人們使用工程化腫瘤靶向細(xì)菌作為癌癥檢測(cè)的可編程載體。

Panteli等人對(duì)一種腸道沙門(mén)氏菌減毒菌株進(jìn)行了基因改造，其毒性比野生型菌株低10000倍，可以釋放出作為熒光生物標(biāo)記物或“熒光標(biāo)記物”的ZsGreen。在對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行靜脈給藥后，血清中的熒光標(biāo)記物水平取決于腫瘤質(zhì)量，可通過(guò)數(shù)學(xué)建模預(yù)測(cè)其檢測(cè)腫瘤的能力。

細(xì)菌用于早期癌癥檢測(cè)仍需要應(yīng)對(duì)幾個(gè)挑戰(zhàn)。盡管包括梭菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌在內(nèi)的工程菌株已被證明對(duì)動(dòng)物和人類(lèi)無(wú)致病性，但細(xì)菌成分的固有毒性和恢復(fù)毒性的可能性帶來(lái)了安全問(wèn)題。此外，目前還不清楚是否所有缺乏壞死核心的腫瘤類(lèi)型和新生病變都能被系統(tǒng)輸送的細(xì)菌定植。

合成生物學(xué)的進(jìn)步可以提供這些挑戰(zhàn)的解決方案，同時(shí)也為設(shè)計(jì)具有特定和受控行為的“智能”微生物提供了機(jī)會(huì)。例如，使用群體感應(yīng)生物電路設(shè)計(jì)的細(xì)菌可用于細(xì)菌通信，以同步活動(dòng)，并產(chǎn)生緊急行為，如在達(dá)到閾值種群密度后，定時(shí)釋放治療藥物，以殺死腫瘤或促進(jìn)系統(tǒng)性抗腫瘤免疫。應(yīng)用于早期癌癥檢測(cè)領(lǐng)域，這些生物電路有可能通過(guò)降低健康組織的背景活性來(lái)增加特異性。在未來(lái)，這些基因可編程載體可能有潛力被開(kāi)發(fā)成安全和定期攝入的食品（例如酸奶），以便進(jìn)行常規(guī)癌癥篩查或癌癥化學(xué)預(yù)防。

合成生物標(biāo)志物的臨床前研究

已有大量臨床前研究報(bào)告表明，基于活性的合成生物標(biāo)記物具有實(shí)現(xiàn)早期檢測(cè)所需LOD的潛力。

在異種移植小鼠模型中，由IONPs與獨(dú)特肽底物結(jié)合組成的基于活性的傳感器能夠識(shí)別LS174T大腸腫瘤，其體積比血清生物標(biāo)記物CEA檢測(cè)到的體積小60％。Kwon等人報(bào)道了一種基于活性分子的傳感器，該傳感器結(jié)合了腫瘤穿透肽，在原位卵巢癌模型中靶向并增加其對(duì)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的傳遞，以進(jìn)一步降低LOD。通過(guò)量化尿液中富集的合成生物標(biāo)記物，他們報(bào)告了當(dāng)中位結(jié)節(jié)直徑小于2mm且平均總腫瘤負(fù)荷為36 mm3時(shí)，以近乎完美的精確度（AUROC為0．99）檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移的能力。相比之下，只有當(dāng)平均腫瘤負(fù)荷達(dá)到88 mm3時(shí)，人類(lèi)附睪蛋白4（HE4）血清生物標(biāo)記物才能指示腫瘤轉(zhuǎn)移。

關(guān)于基因編碼的合成生物標(biāo)記物的體內(nèi)LOD研究也有報(bào)道。Aalipour等人的研究表明，過(guò)繼轉(zhuǎn)移的工程化巨噬細(xì)胞傳感器檢測(cè)到中等大小的CT26大腸腫瘤（體積50–250 mm3），其敏感性和特異性為100％，在將其巨噬細(xì)胞傳感器的性能與LS174T腫瘤分泌的血漿CEA或CT26腫瘤釋放的cfDNA進(jìn)行比較的基準(zhǔn)研究中，他們報(bào)告了較低的LOD。CEA可檢測(cè)到體積約136 mm3的腫瘤，而cfDNA可檢測(cè)到體積大于1500 mm3的腫瘤。

合成生物標(biāo)志物的臨床研究

由于該領(lǐng)域尚處于起步階段，合成生物標(biāo)記物的人體應(yīng)用尚未進(jìn)入關(guān)鍵試驗(yàn)。目前，在臨床試驗(yàn)中進(jìn)展最快的合成生物標(biāo)記物是聚乙二醇化肽，根據(jù)最近一期研究的初步數(shù)據(jù)，健康志愿者對(duì)其耐受性良好且安全。

合成生物標(biāo)記物的前幾個(gè)臨床應(yīng)用案例需要仔細(xì)考慮，因?yàn)樵缙谑�敗可能�?huì)使該領(lǐng)域倒退。篩查無(wú)癥狀患者的早期癌癥是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的工作，在臨床試驗(yàn)驗(yàn)證研究中可能會(huì)帶來(lái)倫理挑戰(zhàn)。例如，合成生物標(biāo)記物檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的患者可能需要等待成像確認(rèn)（即允許腫瘤生長(zhǎng)），然后才能進(jìn)行治療干預(yù)。潛在的臨床切入點(diǎn)，如治療反應(yīng)的藥效學(xué)評(píng)估或首次切除術(shù)后復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)，可以檢測(cè)合成生物標(biāo)記物方法的效用。

值得注意的是，隨著該領(lǐng)域向人體試驗(yàn)的發(fā)展，構(gòu)成合成生物標(biāo)記物的許多組件和載體正在進(jìn)行臨床評(píng)估，在人體內(nèi)有已證明的安全記錄，或已獲得FDA批準(zhǔn)。例如，用于術(shù)中檢測(cè)腫瘤邊緣的成像探針中使用的蛋白酶激活底物。同樣，對(duì)于基因編碼的合成生物標(biāo)記物，許多臨床試驗(yàn)都強(qiáng)調(diào)了減毒細(xì)菌作為靶向腫瘤和提供治療的載體的安全性和實(shí)用性。這些先例提供了對(duì)合成生物標(biāo)記物實(shí)施例的更廣泛理解，這些合成生物標(biāo)記物將是安全的，并在人類(lèi)耐受性良好。

展望

盡管合成生物標(biāo)記物這一新興領(lǐng)域令人興奮且充滿(mǎn)希望，但我們目前對(duì)癌癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)還存在一些空白，需要在應(yīng)對(duì)技術(shù)挑戰(zhàn)的同時(shí)加以填補(bǔ)，以指導(dǎo)未來(lái)的進(jìn)展。特別是，對(duì)早期病變的生物學(xué)以及前體病變何時(shí)和如何轉(zhuǎn)化為惡性腫瘤的理解有限，但需要這些信息來(lái)指導(dǎo)傳感器工程策略。這突出了合成生物標(biāo)記物領(lǐng)域?qū)Π┌Y早期檢測(cè)的挑戰(zhàn)。

此外，還有許多問(wèn)題需要回答。例如，對(duì)哪些早期腫瘤或癌前病變可以推動(dòng)傳感器的工程化？機(jī)器學(xué)習(xí)如何支持識(shí)別復(fù)雜生物數(shù)據(jù)集中的關(guān)鍵特征，以實(shí)現(xiàn)合成生物標(biāo)記物所需的預(yù)測(cè)能力？哪些人群將從早期檢測(cè)中受益最大？患者多久可以接受一次篩查？在什么情況下可以使用相同的探針檢測(cè)癌癥復(fù)發(fā)？與目前的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)相比，對(duì)“高�！被颊哌M(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)的成本有多高？如何克服患者和腫瘤的異質(zhì)性以確保診斷的準(zhǔn)確性？

盡管目前的未知數(shù)似乎比得到的答案更多，但我們可以相信，通過(guò)多學(xué)科的努力，以及科學(xué)家大膽創(chuàng)新的愿景，解決方案將以越來(lái)越快的速度出現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

1．Synthetic biomarkers： a twenty－firstcentury path to early cancer detection． Nat Rev Cancer． 2021 Oct； 21（10）：655–668．

       原文標(biāo)題 : 合成生物標(biāo)志物：未來(lái)的早期癌癥檢測(cè)方法