CAR－NK的優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)

CAR－NK細(xì)胞和CAR－T細(xì)胞一樣存在胞外、跨膜和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域。NK細(xì)胞通過另外兩個(gè)共刺激分子，即NKG2D和CD244（2B4）增加其細(xì)胞毒性能力和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，比CAR－T細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤特異性靶向性和細(xì)胞毒性。CAR－NK細(xì)胞療法可能在未來成為CAR－T療法的替代方案，因?yàn)镃AR－NK細(xì)胞具有以下超越CAR－T的幾個(gè)獨(dú)特特征。

首先，異基因NK細(xì)胞對(duì)于過繼性細(xì)胞治療（ACT）是相當(dāng)安全的，因?yàn)樗鼈兺ǔ２唤閷?dǎo)發(fā)生GVHD。此外，NK細(xì)胞僅分泌少量IFN－γ和GM－CSF，不產(chǎn)生啟動(dòng)CRS的IL－1和IL－6。其次，除了通過單鏈抗體識(shí)別腫瘤表面抗原來抑制癌細(xì)胞外，NK細(xì)胞還可以通過多種受體識(shí)別各種配體來抑制癌細(xì)胞，例如自然細(xì)胞毒性受體（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM－1（CD226）。最后，NK細(xì)胞在臨床樣本中非常豐富，可以從外周血（PB）、臍帶血（UCB）、人類胚胎干細(xì)胞（HESC）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPSC）甚至NK－92細(xì)胞系中產(chǎn)生。

與此同時(shí)，CAR－NK也面臨著一些挑戰(zhàn)。首先，在缺乏細(xì)胞因子支持的情況下，輸注細(xì)胞缺乏體內(nèi)持久性是過繼NK細(xì)胞治療的主要缺點(diǎn)之一。雖然它可能更安全的，但它也會(huì)限制NK細(xì)胞免疫治療的效果。其次，快速歸巢到腫瘤床對(duì)于過繼性細(xì)胞治療效果至關(guān)重要，并且受NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞釋放的趨化因子之間復(fù)雜相互作用的控制。然而，NK細(xì)胞歸巢到腫瘤部位的效率一直存在爭(zhēng)議，因此促使人們不斷努力去進(jìn)行改進(jìn)。第三，同CAR－T類似，TME包括免疫抑制分子、免疫抑制細(xì)胞和妨礙免疫細(xì)胞功能的不利環(huán)境，是CAR－NK細(xì)胞治療的主要障礙。最后，基于慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)基因修飾和傳遞的最常用的方法之一。然而，由于自然特性，NK細(xì)胞對(duì)慢病毒具有抗性，這使得基于慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)成為一個(gè)挑戰(zhàn)。

CAR－M的研究進(jìn)展

鑒于CAR－T細(xì)胞治療的成功和CAR－NK細(xì)胞的發(fā)展?jié)摿Γ�研究人員對(duì)開發(fā)用于腫瘤免疫治療的CAR巨噬細(xì)胞（CAR－M）產(chǎn)生了極大的興趣。CAR－M的出現(xiàn)為治療實(shí)體瘤開辟了新的可能性：用特異性CARs修飾人巨噬細(xì)胞，以提高巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤的吞噬活性和抗原呈遞。

目前使用CAR－M治療癌癥已進(jìn)行了多種嘗試。研究人員設(shè)計(jì)了嵌合抗原受體吞噬細(xì)胞（CAR－P），它可以引導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬特定的靶細(xì)胞。

研究證明，表達(dá)Megf10或FcRv胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的CAR－P可促進(jìn)對(duì)靶抗原的吞噬能力。CAR－PMegf10可以特異性地觸發(fā)對(duì)靶向配體的吞噬作用，通過酪氨酸磷酸化的局部信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)吞噬，TCR－CD3ζ可能通過招募syk激酶而促進(jìn)CAR－P的吞噬作用。

全細(xì)胞吞噬是比較罕見的，而啃咬靶細(xì)胞更為頻繁，這表明CAR－P巨噬細(xì)胞與靶細(xì)胞之間的相互作用不足以觸發(fā)直接的全細(xì)胞吞噬。已有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K信號(hào)在大靶點(diǎn)的內(nèi)吞過程中起重要作用，可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用。研究人員將pI3K p85亞單位與CAR－P－FcRv連接起來，形成一個(gè)“串聯(lián)”CAR（CAR－Ptandem）。CAR－Ptandem具有較好的全細(xì)胞吞噬功能。

賓夕法尼亞大學(xué)的研究人員使用含有CD3－ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的抗HER2的CAR－M。在兩種實(shí)體瘤移植的異位小鼠模型中，單次注射抗HER2－CAR－M可降低腫瘤負(fù)荷，延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間。在人源化小鼠模型中還發(fā)現(xiàn)， HER2－CAR－M能夠?qū)�M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M1巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥性腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞毒性。此外，還發(fā)現(xiàn)HER2－CAR－M可能產(chǎn)生表位擴(kuò)散，為避免腫瘤免疫逃逸提供了新思路。

Zhang等人利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）表達(dá)CAR結(jié)構(gòu)并分化為巨噬細(xì)胞，命名為CAR－iMac。研究表明，表達(dá)CAR的iPSCs能分化為巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞，在無抗原的情況下，CAR－iMac更接近M2極化狀態(tài)。然而，在存在特異性抗原的情況下如CD19，CAR介導(dǎo)的信號(hào)促進(jìn)了CAR－iMac的吞噬作用，并導(dǎo)致CAR－iMac向促炎的M1型的轉(zhuǎn)化。iPSC來源的巨噬細(xì)胞可能成為髓系腫瘤免疫治療的重要細(xì)胞來源。

CAR－T治療實(shí)體瘤無效的一個(gè)重要原因是T細(xì)胞難以進(jìn)入腫瘤組織。這是因?yàn)閷?shí)體瘤細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）形成的物理屏障阻止了T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織。ECM由高度有序的纖維分子、糖蛋白和其他大分子產(chǎn)生，其合成和降解主要受基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）的調(diào)控，而巨噬細(xì)胞就是MMP的重要來源。

研究人員設(shè)計(jì)了一種CAR－147的結(jié)構(gòu)，它由靶向人HER2的單鏈抗體、IghG1的鉸鏈區(qū)和小鼠CD147分子的跨膜和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域組成。CAR－147與HER2＋人乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，在CAR－147巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)多個(gè)MMP的表達(dá)，證明CAR－147能特異性識(shí)別HER2抗原，有效激活巨噬細(xì)胞中MMP的表達(dá)。CAR－147巨噬細(xì)胞在體外不抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但靜脈注射CAR－147巨噬細(xì)胞可顯著抑制4T1乳腺癌小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)用CAR－147巨噬細(xì)胞治療的腫瘤中T細(xì)胞所占的比例遠(yuǎn)高于對(duì)照巨噬細(xì)胞治療的腫瘤，說明CAR－147巨噬細(xì)胞能破壞腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)T細(xì)胞向腫瘤浸潤(rùn)。

CAR－M治療實(shí)體瘤的臨床應(yīng)用

直到2020年11月，兩個(gè)基于CAR－M策略的臨床試驗(yàn)已經(jīng)獲得FDA的批準(zhǔn)。第一個(gè)是來自CARISMA Therapeutics的候選藥物CT－0508，它用抗HER2的CAR－M治療復(fù)發(fā)／難治性HER2過度表達(dá)的腫瘤患者（I期臨床試驗(yàn)）。另一個(gè)是Maxyte的MCY－M11，它利用mRNA轉(zhuǎn)染PBMC表達(dá)靶向間皮素的CAR（包括CAR－M），治療復(fù)發(fā)／難治性卵巢癌和腹膜間皮瘤患者，目前正在招募志愿者進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)。

關(guān)于CAR－M的臨床轉(zhuǎn)化，有幾個(gè)方面需要注意：第一，CAR－M的安全性和有效性是該療法的基礎(chǔ)，雖然已經(jīng)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，但CAR－M在人體內(nèi)的安全性和有效性仍有待驗(yàn)證；其次，可靠的細(xì)胞來源和擴(kuò)增是CAR－M臨床應(yīng)用的必要條件，CAR－M可由PBMC或iPSCs制備。此外，與T細(xì)胞不同，巨噬細(xì)胞發(fā)生GVHD的風(fēng)險(xiǎn)較低，這意味著可以提前生產(chǎn)產(chǎn)品，供患者按需使用。第三，還有一個(gè)問題必須考慮，目前，CAR－M多采用病毒轉(zhuǎn)染的方法，可能會(huì)誘發(fā)插入突變， CRISPR／Cas9為解決這一問題提供了新的可能性，僅需一周即可完成CAR－T基因的編輯。

CAR－M的優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)

與CAR－T和CAR－NK細(xì)胞相似，CAR－M細(xì)胞由識(shí)別特定腫瘤抗原的細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)域、跨膜區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)激活信號(hào)區(qū)域組成。目前，對(duì)細(xì)胞外信號(hào)域的研究主要幾種在幾種常見的腫瘤靶點(diǎn)，如CD19和HER2。

與CAR－T細(xì)胞不同，CAR－M細(xì)胞具有以下三個(gè)優(yōu)點(diǎn)。

1）由于腫瘤細(xì)胞周圍基質(zhì)形成的物理屏障，T細(xì)胞不能進(jìn)入腫瘤環(huán)境，而巨噬細(xì)胞可以明顯地浸入腫瘤環(huán)境中。TAM在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫抑制和血管生成中起著重要作用。CAR－M能降低TAM的比例，影響TAM的細(xì)胞表型，對(duì)腫瘤的治療有積極作用。

2）CAR－M除了具有吞噬腫瘤細(xì)胞的作用外，還具有促進(jìn)抗原提呈能力和增強(qiáng)T細(xì)胞殺傷的作用。

3）與CAR－T相比，CAR－M的循環(huán)時(shí)間有限，非腫瘤靶向毒性較小。

盡管CAR－M有很大的潛力成為一種強(qiáng)有力的腫瘤免疫治療方法，但要達(dá)到預(yù)期的效果還需要克服許多問題。首先是細(xì)胞數(shù)量的限制：無論是在體外還是在體內(nèi)注射后，巨噬細(xì)胞都不會(huì)增殖�；颊咧荒芙邮苡邢迶�(shù)量的巨噬細(xì)胞，這可能會(huì)影響治療效果。二是與巨噬細(xì)胞在體內(nèi)的遷移特性有關(guān)。注射后，外源性巨噬細(xì)胞通過肺部，然后大部分留在肝臟，不利于癌癥的治療。三是復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境。盡管CAR－M在小鼠模型中取得了很好的效果，但人類實(shí)際的腫瘤微環(huán)境要比動(dòng)物模型復(fù)雜得多。最后，由于腫瘤細(xì)胞的高度異質(zhì)性，靶抗原的表達(dá)可能不夠。這一問題在CAR－T治療中一直非常突出。臨床研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)被CAR－T細(xì)胞去除的腫瘤細(xì)胞都有高水平的靶抗原表達(dá)�？梢灶A(yù)見，這也將成為CAR－M療法發(fā)展的一大障礙。

小結(jié)

NK細(xì)胞是一類獨(dú)特的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，具有不受 MHC 限制的細(xì)胞毒性、產(chǎn)生細(xì)胞因子和免疫記憶等功能。CAR－NK細(xì)胞療法是一個(gè)很有前途的臨床研究領(lǐng)域，對(duì)某些癌癥患者具有良好的安全性和初步療效。CAR－M療法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已顯示出其有效的抗腫瘤能力。與CAR－T和CAR－NK相比，CAR－M作為一種新的細(xì)胞免疫療法有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但也有許多不足需要克服。因此，在今后的臨床治療中應(yīng)注意最大限度地提高CAR－M的有效性和安全性。我們有理由相信，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，CAR－NK和CAR－M很快將在患者身上顯示出療效，為腫瘤免疫治療再添助力！

參考文獻(xiàn)：

1． Chimeric antigen receptornatural killer （CAR－NK） cell design and engineering for cancer therapy． JHematol Oncol． 2021； 14： 73．

2． Natural Born Killers： NK Cells in Cancer Therapy． Cancers （Basel）． 2020 Jul 31；12（8）：2131

3． CAR－macrophage： A newimmunotherapy candidate against solid tumors． Biomed Pharmacother． 2021 Jul；139：111605．  

       原文標(biāo)題 : 無所不CAR：從CAR-T、CAR-NK到CAR-M