前言

臨床成功的ADCs的設(shè)計(jì)不僅取決于有效載荷的效力及其附著點(diǎn)、連接子的穩(wěn)定性和有效的藥物釋放，而且還取決于抗體和生物偶聯(lián)技術(shù)的選擇。在過去10年中，所有經(jīng)FDA批準(zhǔn)的ADC都是以ADC的異構(gòu)混合物的形式存在，單抗的不同位置上附著著不同數(shù)量的藥物。偶聯(lián)位點(diǎn)對ADC穩(wěn)定性及其藥代動(dòng)力學(xué)具有顯著的影響，高DAR（藥物抗體比）常常導(dǎo)致血漿清除迅速，而低DAR的ADC則表現(xiàn)出的活性較弱。在ADC的藥物中，裸單抗的存在是一種有效的競爭抑制劑。因此，在過去十年中，人們開發(fā)了一大批新的偶聯(lián)策略，目的是控制小分子藥物的位置和數(shù)量，同時(shí)保持結(jié)構(gòu)完整性和同質(zhì)性。

基于化學(xué)的特異性原位抗體修飾

單克隆抗體的天然結(jié)構(gòu)為生物偶聯(lián)提供了多種可能性，基于化學(xué)的、特異性的天然（非工程）抗體偶聯(lián)具有一些優(yōu)點(diǎn)。它可以避免抗體特定位點(diǎn)突變的復(fù)雜性，以及在細(xì)胞培養(yǎng)的放大和優(yōu)化方面可能面臨的挑戰(zhàn)。

偶聯(lián)位點(diǎn)根據(jù)抗體序列，賴氨酸、組氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等內(nèi)源性氨基酸在二硫鍵間的連接位點(diǎn)非常具有吸引力。所有經(jīng)FDA批準(zhǔn)的ADC，直到2021年，都利用這些內(nèi)源性氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)。然而，抗體支架還包含聚糖，這是在單克隆抗體生產(chǎn)過程中，F(xiàn)C區(qū)域的翻譯后修飾所導(dǎo)致的。一些研究報(bào)告了糖工程化的新策略，這似乎是一種有趣的生物偶聯(lián)替代方法。

與內(nèi)源性氨基酸的偶聯(lián)

最常見的偶聯(lián)方法之一是利用抗體的賴氨酸殘基，氨基酸親核NH2基團(tuán)與利克有效載荷上親電的N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。盡管反應(yīng)簡單，但可利用賴氨酸殘基的高豐度導(dǎo)致了許多ADC在隨機(jī)分布下的不均勻混合物的形成。DAR受藥物／抗體化學(xué)計(jì)量比的控制，該方法得到廣泛應(yīng)用，包括已獲批的ADC，如Besponsa， Mylotarg， 和Kadcyla。

最近，同樣也報(bào)道了對賴氨酸位點(diǎn)和殘基的特異性修飾。通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，磺酰丙烯酸酯被用作中間試劑，用于在天然蛋白質(zhì)序列上對單個(gè)賴氨酸殘基進(jìn)行修飾。

反應(yīng)的區(qū)域選擇性歸咎于磺酰丙烯酸酯的設(shè)計(jì)以及每個(gè)賴氨酸周圍獨(dú)特的局部微環(huán)境。通過計(jì)算預(yù)測，pKa最低的賴氨酸容易以位點(diǎn)特異性的方式在弱堿性pH下優(yōu)先反應(yīng)。即使在其他親核殘基如半胱氨酸存在的情況下也觀察到了這種反應(yīng)。該技術(shù)已應(yīng)用于5種不同的蛋白質(zhì)和曲妥珠單抗，在偶聯(lián)后均保留了原有的二級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能。

2018年，Rai等人報(bào)告了另一種利用“化學(xué)關(guān)鍵蛋白”的可逆分子間反應(yīng)進(jìn)行的位點(diǎn)特異性修飾。該試劑攜帶多種官能團(tuán)，這些官能團(tuán)在所有可獲得的賴氨酸殘基上可逆地形成亞胺部分。然后，關(guān)鍵蛋白通過試劑中的環(huán)氧化物與近端組氨酸殘基反應(yīng)。因此，在生理?xiàng)l件下，關(guān)鍵蛋白從賴氨酸中分離，醛被再生，從而能夠通過肟結(jié)合標(biāo)記抗體。

這種關(guān)鍵蛋白的定向修飾技術(shù)后來發(fā)展成單賴氨酸殘基標(biāo)記技術(shù)，即使在存在N－末端胺的情況下也具有毋庸置疑的選擇性。方法的成功依賴于Fk1－間隔子－Fk2試劑。

Fk1官能團(tuán)與賴氨酸可逆反應(yīng)，調(diào)節(jié)Fk2近端賴氨酸部分的微環(huán)境。然后通過酰胺鍵在Fk2處的賴氨酸殘基（K169和K395）進(jìn)行偶聯(lián)，間隔子的設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)偶聯(lián)的位置。該方法已成功應(yīng)用于ADC（trastuzumab－emtansine）的合成，證明其細(xì)胞活性與已獲批準(zhǔn)的Kadcyla相當(dāng)。

Merlul等人最近報(bào)道了一種不同的結(jié)合策略，有效地靶向天然抗體上的組氨酸殘基。他們引入了一種基于陽離子有機(jī)金屬鉑（II）的連接子，［乙二胺鉑（II）］2＋，圖中表示為Lx。

這種技術(shù)基于絡(luò)合和偶聯(lián)兩個(gè)步驟。氮雜環(huán)配體如哌啶與Lx配位形成絡(luò)合物前體，穩(wěn)定的中間體包含有效載荷和配體上的一個(gè)氯離子。該復(fù)合物含有帶正電荷的Pt（II）中心，這提高了連接子和有效載荷復(fù)合物的水溶性并最小化抗體聚集，該方法還擴(kuò)展到類似的碘絡(luò)合物。在最近的一份報(bào)告中，碘化鈉的使用被證明可以顯著提高該技術(shù)的偶聯(lián)產(chǎn)率和選擇性。Cl－Lx－藥物載荷絡(luò)合物上殘留的氯配基與碘化物的交換生成更具活性的I－Lx－藥物載荷，從而獲得更高的偶聯(lián)產(chǎn)率。這項(xiàng)技術(shù)已被應(yīng)用于ADC藥物的大規(guī)模生產(chǎn)。

二硫化物重橋接策略

IgG抗體包含四個(gè)鏈間二硫鍵，兩個(gè)連接輕鏈和重鏈，兩個(gè)位于連接兩條重鏈的鉸鏈區(qū)，它們維持著單克隆抗體的完整性。另一個(gè)經(jīng)典的生物偶聯(lián)途徑探索了這些半胱氨酸作為有效載荷連接點(diǎn)的作用。四個(gè)二硫鍵的還原通常會(huì)產(chǎn)生八個(gè)巰基，它們能夠與馬來酰亞胺的連接子反應(yīng)，從而產(chǎn)生DAR為8的ADC。

Doronina及其同事報(bào)告了嵌合抗CD30單克隆抗體偶聯(lián)MMAE，DAR＝8的 ADC實(shí)例。與經(jīng)典的賴氨酸偶聯(lián)相比，這種有效載荷加載方式得到了更好的控制。然而，據(jù)報(bào)道，較高的藥物負(fù)荷會(huì)增加聚集的風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致高血漿清除率，并降低體內(nèi)療效。

Badescu和al在2014年報(bào)告了一種新的位點(diǎn)特異性重橋接偶聯(lián)策略，他們是第一個(gè)證明新的雙砜（bis－sulfone）能夠烷基化來自抗體和抗體片段中還原二硫鍵的兩個(gè)巰基，對抗原結(jié)合的影響最小。后來，Wang和al描述了一種新的水溶性烯丙砜（allyl sulfone），該試劑在沒有原位活化的情況下提高了反應(yīng)活性。它表現(xiàn)出高穩(wěn)定性、高水溶性和位點(diǎn)特異性。

此外，還有巰基炔與末端炔烴和環(huán)辛炔生物偶聯(lián)的再橋接技術(shù)，其進(jìn)一步發(fā)展出新一代馬來酰亞胺，如二溴－（DBM）和二硫代馬來酰亞胺（DTM），用于位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。這些馬來酰亞胺類似物在第3位和第4位含有良好的脫離基團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)快速、高效和高產(chǎn)率的偶聯(lián)。最近報(bào)道了結(jié)合二溴和二硫代馬來酰亞胺性質(zhì)的雜化硫代溴馬來酰亞胺（TBM），這種TBM試劑結(jié)合更快，顯示出更高的DAR＝4的百分比，這可能是由于溴減少了空間位阻。

2015年，Chudasama等人引入了一類新的重橋接試劑，二溴吡啶二酮（dibromopyridazinediones）。他們證明了它能有效地插入到二硫鍵中，得到的結(jié)構(gòu)即使在高溫下也表現(xiàn)出了極好的水解穩(wěn)定性。然而，隨著還原步驟上的溫度升高，也觀察到不均一性，這種結(jié)構(gòu)也允許選擇性地引入不同的功能基團(tuán)。

二乙烯基嘧啶（Divinylpyrimidine）是另一種有效的重橋接試劑，能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的DAR＝4的ADC。Spring等人研究了乙烯基雜芳基支架對半胱氨酸再橋接的作用，他們認(rèn)為用嘧啶取代吡啶可以使雜芳環(huán)成為更好的電子受體，從而提高交聯(lián)效率。他們的工作擴(kuò)展到二乙烯基三嗪，在高溫下，重橋接顯示出更高的效率。

為了避免與經(jīng)典馬來酰亞胺偶聯(lián)相關(guān)的體內(nèi)不穩(wěn)定性的缺點(diǎn)，Barbas等人研究了甲基磺�；�苯基惡二唑，該試劑對半胱氨酸具有特異性反應(yīng)。與血漿中的半胱氨酸－馬來酰亞胺偶聯(lián)物相比，他們的穩(wěn)定性更高。受此啟發(fā)，Zeglis設(shè)計(jì)了DiPODS試劑，該試劑含有兩個(gè)通過苯基連接的惡二唑基甲基砜部分， DiPODS以重橋接的方式與兩個(gè)硫酸根形成共價(jià)鍵。與馬來酰亞胺偶聯(lián)相比，以這種方式偶聯(lián)具有優(yōu)越的體外穩(wěn)定性和體內(nèi)性能。

聚糖偶聯(lián)

由于IgG是一種糖蛋白，它在Fc片段每個(gè)重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域N297位置包含一個(gè)N－聚糖，這種糖基化可以作為連接有效載荷的附著點(diǎn)。多糖與Fab區(qū)域間遠(yuǎn)距離定位降低了在偶聯(lián)后損害抗體的抗原結(jié)合能力的風(fēng)險(xiǎn)，此外，與抗體的肽鏈相比，它們的化學(xué)組成不同，允許位點(diǎn)特異性修飾，使它們成為合適的偶聯(lián)位點(diǎn)。

聚糖生物偶聯(lián)可根據(jù)用于靶向碳水化合物的技術(shù)來區(qū)分：包括聚糖代謝工程化、聚糖氧化后的糖轉(zhuǎn)移酶處理、內(nèi)糖苷酶和轉(zhuǎn)移酶處理后的酮或疊氮化物標(biāo)記。

Neri等人報(bào)道了在IgG抗體的N－糖基化位點(diǎn)處巖藻糖的位點(diǎn)特異性修飾。這種糖含有一個(gè)順式二醇部分，適合選擇性氧化。他們用偏高碘酸鈉氧化巖藻糖殘基，生成一個(gè)能夠與含聯(lián)氨的連接子反應(yīng)的醛基，這樣，抗體通過腙鍵與藥物相連。

Senter及其同事向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加硫基類似物，通過代謝將6－硫代巖藻糖帶入抗體修飾。他們認(rèn)為，取代是通過劫持巖藻糖基化途徑來完成的，這樣就引入了化學(xué)位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性結(jié)合。與經(jīng)典半胱氨酸偶聯(lián)物相比，這種方法顯著降低了異質(zhì)性水平，并產(chǎn)生具有更可預(yù)測的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)特性的偶聯(lián)物。

重組IgG中很少含有唾液酸，然而，已經(jīng)證明，利用半乳糖基和唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以酶法改造甘氨酸。通過酶反應(yīng)添加半乳糖以獲得G2聚糖，然后添加末端唾液酸。這種修飾通過高碘酸氧化生成醛基，可以偶聯(lián)帶羥胺基團(tuán)的連接子－有效載荷。所得的偶聯(lián)物具有較高的靶向選擇性，體內(nèi)抗腫瘤活性良好。高碘酸還可氧化蛋氨酸等敏感氨基酸，影響與FcRn的結(jié)合。

除這些偶聯(lián)策略外，半乳糖殘基也可以作為修飾位點(diǎn)。多項(xiàng)研究報(bào)告了通過使用突變的β－ 1，4－半乳糖轉(zhuǎn)移酶，將半乳糖替換為一種含酮或疊氮官能團(tuán)的半乳糖，這種具有雙正交官能團(tuán)的半乳糖衍生物為高效偶聯(lián)開辟了途徑。這些技術(shù)已被開發(fā)用于成像和抗癌應(yīng)用。

從化膿性鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)糖苷酶EndoS和EndoS2，這些酶能夠水解IgG的N－聚糖，從而使水解后的殘基成為生物偶聯(lián)的有效位點(diǎn)。這種方法有助于使單抗的聚糖結(jié)構(gòu)均勻化，同時(shí)它也適用于任何IgG亞型。此類方法應(yīng)用于trastuzumab－maytansine，制備出具有良好體外和體內(nèi)藥效的糖偶聯(lián)ADC。