工程化抗體的位點特異性生物偶聯(lián)

生物正交化學和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的進展有助于產(chǎn)生更均勻的ADC。盡管在天然單抗上有許多可用的附著方法可供選擇，但在工程化抗體上的位點特異性生物偶聯(lián)能夠更有效地控制DAR，并且避免改變與抗原結(jié)合的親和力。這樣，在某些位置加入天然或非天然氨基酸，得到具有優(yōu)良藥代動力學和藥效學特征的同質(zhì)產(chǎn)品。

酶法

有效載荷的附著可以通過在抗體序列中插入特定的氨基酸標簽以非常有選擇性的方式實現(xiàn)。這些標簽被特定的酶所識別，例如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（MTG）、轉(zhuǎn)肽酶或酪氨酸酶，從而能夠執(zhí)行位點特異性偶聯(lián)。

Aaron等人探索了一種新的利用醛標記蛋白質(zhì)的位點特異性偶聯(lián)。該技術(shù)利用了基因編碼的五肽序列（Cys－X－Pro－X－Arg），其中半胱氨酸殘基被FGE識別，并在細胞中蛋白質(zhì)表達期間被共翻譯氧化為甲酰甘氨酸。這樣，工程化抗體通過HIPS（hydrazino－Pictet–Spengler）化學方法與醛特異性連接子選擇性偶聯(lián)。

微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（MTGase）策略也經(jīng)常被開發(fā)用于定位特異性偶聯(lián)。MTGase催化在脫糖抗體295位置的谷氨酰胺側(cè)鏈與底物的伯胺之間形成肽鍵。與其他酶策略相比，MTG是一種靈活的技術(shù)，不需要肽供體來實現(xiàn)偶聯(lián)。只要�；�受體含有一種伯胺，就沒有結(jié)構(gòu)限制。

谷氨酰胺殘基自然存在于單抗的每個重鏈的Fc區(qū)域。在295位去糖基化后，谷氨酰胺殘基通過MTGase介導的反應(yīng)偶聯(lián)，可以產(chǎn)生均一的DAR＝2的ADC。為了提高效率，可以偶聯(lián)帶支鏈的連接子，從而使DAR翻倍，297位的天冬酰胺突變?yōu)楣劝滨０芬部稍黾覦AR。

NBE Therapeutics開發(fā)了基于S金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)肽酶A介導的偶聯(lián)。他們的策略利用轉(zhuǎn)肽酶A（SrtA），在LPXTG（X＝任何氨基酸）五肽的基序中切割蘇氨酸和甘氨酸殘基之間的酰胺鍵。然后，它催化甘氨酸相關(guān)的有效載荷與新生成的C－末端的偶聯(lián)，在生理溫度和pH下生成肽鍵。

該方法應(yīng)用于不同抗體，如抗CD30和抗Her2，并使用含有5甘氨酸標記的連接子偶聯(lián)maytansine和MMAE，兩種ADC均顯示出與經(jīng)典偶聯(lián)相似的體外細胞殺傷活性。酶法產(chǎn)生的trastuzumab－maytansine在體內(nèi)試驗中完全匹配Kadcyla。

在另一個例子中，利用轉(zhuǎn)肽酶法生成了高效蒽環(huán)素毒素衍生物PNU－159682的ADC。有趣的是，通過這項技術(shù)，偶聯(lián)效率甚至高于Adcetris和Kadcyla類似物。此外，所制備的PNU－159682 ADC具有較高的體外和體內(nèi)穩(wěn)定性，并且顯示出的效力超過了含有微管蛋白靶向有效載荷的ADC。

另一個新興的新方法是通過酪氨酸標簽進行位點特異性抗體標記，酪氨酸標簽與單克隆抗體輕鏈的C末端基因融合�？紤]到位點可及性，Bruins及其同事使用了一種工程化的四甘氨酰酪氨酸殘基作為標記，它為偶聯(lián)提供了一個容易觸及的位點。酪氨酸酶將酪氨酸氧化成1，2－醌，從而允許與各種雙環(huán)［6．1．0］壬炔（BCN）衍生物的環(huán)加成反應(yīng)。這種方法可以與含有BCN連接子的MMAE有效地偶聯(lián)。

半胱氨酸工程：硫單抗技術(shù)

隨機半胱氨酸偶聯(lián)和重橋接是利用抗體結(jié)構(gòu)內(nèi)天然存在的半胱氨酸殘基的技術(shù)。然而，隨機半胱氨酸方法的異質(zhì)性以及重橋接策略中的單抗片段化需要在ADC合成中加以考慮，特別是當疏水性藥物被偶聯(lián)時。

與它們不同的是，硫單抗技術(shù)通過利用不涉及結(jié)構(gòu)二硫鍵的工程化反應(yīng)性半胱氨酸，在抗體上實現(xiàn)所需位點的選擇性和均勻修飾。一般來說，半胱氨酸突變的設(shè)計是為了促進細胞毒性有效載荷偶聯(lián)的同時，保持單克隆抗體的穩(wěn)定性、親和力和最小化ADC聚集。為了確定突變的最佳位置，通常采用幾種技術(shù)，包括計算建模、模型系統(tǒng)篩選和高通量掃描。

Junutula等人首先報道了一種硫單抗策略，用工程化半胱氨酸殘基取代了抗MUC16抗體重鏈114位的丙氨酸（HC－A114），工程化位置內(nèi)的反應(yīng)性硫醇能夠與馬來酰亞胺負載的連接子反應(yīng)。合成的抗MUC16 ADC在異種移植小鼠模型中表現(xiàn)出效力，在大鼠和食蟹猴中表現(xiàn)出高劑量耐受性，這個發(fā)現(xiàn)建立了硫單抗偶聯(lián)策略的一般性方法。

此外，琥珀酰亞胺連接在胞漿內(nèi)可以經(jīng)歷兩個平行反應(yīng)：反向Michael反應(yīng)導致連接子－有效載荷的損失，以及琥珀酰亞胺的水解，這兩種反應(yīng)都對體內(nèi)ADC活性有顯著影響。為了提高穩(wěn)定性，Lyon和合作者設(shè)計了一個與馬來酰亞胺相鄰的堿性氨基整合進來的連接子。在連接子中加入二氨基丙酸（DPR）促進了硫琥珀酰亞胺在中性pH和室溫下的快速定量水解，這樣，非特異性的去偶聯(lián)作用被阻止，從而提高了體內(nèi)的穩(wěn)定性。除了常用的馬來酰亞胺外，還探索了不同的半胱氨酸反應(yīng)劑，如碘乙酰胺、溴甲酰胺、羰基丙烯酸酯，N－烷基乙烯基吡啶鹽。

與工程化非天然氨基酸的生物偶聯(lián)

除了硫單抗技術(shù)外，非標準氨基酸（ncAA）的加入為位點特異性偶聯(lián)提供了另一種可能性。該技術(shù)使用含有獨特化學結(jié)構(gòu)的氨基酸，從而能夠以化學選擇性的方式引入連接子－有效載荷復合物。該技術(shù)需要對抗體序列重組，利用與宿主細胞內(nèi)所有內(nèi)源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶（aaRS），用于響應(yīng)未賦值密碼子將ncAA帶入蛋白質(zhì)。通常，ncAA在發(fā)酵過程中被添加到培養(yǎng)基中。選擇非天然氨基酸是很重要的，因為它們可能激發(fā)免疫原性。常用的ncAA是具有獨特基團的天然氨基酸的類似物，如酮、疊氮、環(huán)丙烯或二烯。

已有研究將對乙酰苯丙氨酸（pAcF）成功地整合入抗CXCR4 抗體中。有效載荷Auristin通過肟連接與抗體有效偶聯(lián)，從而生成化學均一的ADC。該ADC在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的體外活性和完全清除肺腫瘤的作用。

由于肟連接所需的酸性條件和ADC緩慢釋放的動力學，另一種選擇是加入含ncAA的疊氮化物。廣泛應(yīng)用的對疊氮哌苯胺（pAzF）可在生理條件下快速進行CuAAC或SPAAC反應(yīng)，利用這種策略成功地在抗CD74抗體上偶聯(lián)糖皮質(zhì)激素有效載荷。除了pAcF技術(shù)外，還成功地將含疊氮的賴氨酸類似物（AzK）帶入到抗體中，以產(chǎn)生具有Auristin、PBD二聚體或微管蛋白有效載荷的位點特異性ADC。

此外，賴氨酸的環(huán)丙烯衍生物（CypK）以及自然發(fā)生的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）都成功地整合進入抗體中。所產(chǎn)生的ADC表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性、選擇性以及體外和體內(nèi)活性。

小結(jié)

在過去的幾年里，ADC的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和機制擴展方面取得了許多進展。新的偶聯(lián)技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)出來，以獲得對腫瘤的更高選擇性。這些偶聯(lián)技術(shù)使ADC具有更好的穩(wěn)定性、選擇性以及體外和體內(nèi)活性。這些新型偶聯(lián)技術(shù)的初步數(shù)據(jù)令人鼓舞，未來將極大地促進ADC藥物的迅猛發(fā)展。

參考文獻：

1．The Chemistry Behind ADCs． Pharmaceuticals （Basel）． 2021 May； 14（5）： 442．

       原文標題 : ADC生物偶聯(lián)技術(shù)的最新研究進展