生物偶聯(lián)技術(shù)

1． 基于化學(xué)的特異性原位抗體修飾

單克隆抗體的天然結(jié)構(gòu)為生物偶聯(lián)提供了多種可能性,基于化學(xué)的、特異性的天然(非工程)抗體偶聯(lián)具有一些優(yōu)點(diǎn)。它可以避免抗體特定位點(diǎn)突變的復(fù)雜性,以及在細(xì)胞培養(yǎng)的放大和優(yōu)化方面可能面臨的挑戰(zhàn)。

偶聯(lián)位點(diǎn)根據(jù)抗體序列,賴(lài)氨酸、組氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等內(nèi)源性氨基酸在二硫鍵間的連接位點(diǎn)非常具有吸引力。所有經(jīng)FDA批準(zhǔn)的ADC,直到2021年,都利用這些內(nèi)源性氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)。然而,抗體支架還包含聚糖,這是在單克隆抗體生產(chǎn)過(guò)程中,FC區(qū)域的翻譯后修飾所導(dǎo)致的。一些研究報(bào)告了糖工程化的新策略,這似乎是一種有趣的生物偶聯(lián)替代方法。

與內(nèi)源性氨基酸的偶聯(lián)

最常見(jiàn)的偶聯(lián)方法之一是利用抗體的賴(lài)氨酸殘基,氨基酸親核NH2基團(tuán)與利克有效載荷上親電的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。盡管反應(yīng)簡(jiǎn)單,但可利用賴(lài)氨酸殘基的高豐度導(dǎo)致了許多ADC在隨機(jī)分布下的不均勻混合物的形成。DAR受藥物/抗體化學(xué)計(jì)量比的控制,該方法得到廣泛應(yīng)用,包括已獲批的ADC,如Besponsa, Mylotarg, 和Kadcyla。

最近,同樣也報(bào)道了對(duì)賴(lài)氨酸位點(diǎn)和殘基的特異性修飾。通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì),磺酰丙烯酸酯被用作中間試劑,用于在天然蛋白質(zhì)序列上對(duì)單個(gè)賴(lài)氨酸殘基進(jìn)行修飾。

反應(yīng)的區(qū)域選擇性歸咎于磺酰丙烯酸酯的設(shè)計(jì)以及每個(gè)賴(lài)氨酸周?chē)��?dú)特的局部微環(huán)境。通過(guò)計(jì)算預(yù)測(cè),pKa最低的賴(lài)氨酸容易以位點(diǎn)特異性的方式在弱堿性pH下優(yōu)先反應(yīng)。即使在其他親核殘基如半胱氨酸存在的情況下也觀(guān)察到了這種反應(yīng)。該技術(shù)已應(yīng)用于5種不同的蛋白質(zhì)和曲妥珠單抗,在偶聯(lián)后均保留了原有的二級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能。

2018年,Rai等人報(bào)告了另一種利用“化學(xué)關(guān)鍵蛋白”的可逆分子間反應(yīng)進(jìn)行的位點(diǎn)特異性修飾。該試劑攜帶多種官能團(tuán),這些官能團(tuán)在所有可獲得的賴(lài)氨酸殘基上可逆地形成亞胺部分。然后,關(guān)鍵蛋白通過(guò)試劑中的環(huán)氧化物與近端組氨酸殘基反應(yīng)。因此,在生理?xiàng)l件下,關(guān)鍵蛋白從賴(lài)氨酸中分離,醛被再生,從而能夠通過(guò)肟結(jié)合標(biāo)記抗體。

這種關(guān)鍵蛋白的定向修飾技術(shù)后來(lái)發(fā)展成單賴(lài)氨酸殘基標(biāo)記技術(shù),即使在存在N-末端胺的情況下也具有毋庸置疑的選擇性。方法的成功依賴(lài)于Fk1-間隔子-Fk2試劑。

Fk1官能團(tuán)與賴(lài)氨酸可逆反應(yīng),調(diào)節(jié)Fk2近端賴(lài)氨酸部分的微環(huán)境。然后通過(guò)酰胺鍵在Fk2處的賴(lài)氨酸殘基(K169和K395)進(jìn)行偶聯(lián),間隔子的設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)偶聯(lián)的位置。該方法已成功應(yīng)用于A(yíng)DC(trastuzumab-emtansine)的合成,證明其細(xì)胞活性與已獲批準(zhǔn)的Kadcyla相當(dāng)。

Merlul等人最近報(bào)道了一種不同的結(jié)合策略,有效地靶向天然抗體上的組氨酸殘基。他們引入了一種基于陽(yáng)離子有機(jī)金屬鉑(II)的連接子,[乙二胺鉑(II)]2+,圖中表示為L(zhǎng)x。

這種技術(shù)基于絡(luò)合和偶聯(lián)兩個(gè)步驟。氮雜環(huán)配體如哌啶與Lx配位形成絡(luò)合物前體,穩(wěn)定的中間體包含有效載荷和配體上的一個(gè)氯離子。該復(fù)合物含有帶正電荷的Pt(II)中心,這提高了連接子和有效載荷復(fù)合物的水溶性并最小化抗體聚集,該方法還擴(kuò)展到類(lèi)似的碘絡(luò)合物。在最近的一份報(bào)告中,碘化鈉的使用被證明可以顯著提高該技術(shù)的偶聯(lián)產(chǎn)率和選擇性。Cl-Lx-藥物載荷絡(luò)合物上殘留的氯配基與碘化物的交換生成更具活性的I-Lx-藥物載荷,從而獲得更高的偶聯(lián)產(chǎn)率。這項(xiàng)技術(shù)已被應(yīng)用于A(yíng)DC藥物的大規(guī)模生產(chǎn)。

二硫化物重橋接策略

IgG抗體包含四個(gè)鏈間二硫鍵,兩個(gè)連接輕鏈和重鏈,兩個(gè)位于連接兩條重鏈的鉸鏈區(qū),它們維持著單克隆抗體的完整性。另一個(gè)經(jīng)典的生物偶聯(lián)途徑探索了這些半胱氨酸作為有效載荷連接點(diǎn)的作用。四個(gè)二硫鍵的還原通常會(huì)產(chǎn)生八個(gè)巰基,它們能夠與馬來(lái)酰亞胺的連接子反應(yīng),從而產(chǎn)生DAR為8的ADC。

Doronina及其同事報(bào)告了嵌合抗CD30單克隆抗體偶聯(lián)MMAE,DAR=8的 ADC實(shí)例。與經(jīng)典的賴(lài)氨酸偶聯(lián)相比,這種有效載荷加載方式得到了更好的控制。然而,據(jù)報(bào)道,較高的藥物負(fù)荷會(huì)增加聚集的風(fēng)險(xiǎn),從而導(dǎo)致高血漿清除率,并降低體內(nèi)療效。

Badescu和al在2014年報(bào)告了一種新的位點(diǎn)特異性重橋接偶聯(lián)策略,他們是第一個(gè)證明新的雙砜(bis-sulfone)能夠烷基化來(lái)自抗體和抗體片段中還原二硫鍵的兩個(gè)巰基,對(duì)抗原結(jié)合的影響最小。后來(lái),Wang和al描述了一種新的水溶性烯丙砜(allyl sulfone),該試劑在沒(méi)有原位活化的情況下提高了反應(yīng)活性。它表現(xiàn)出高穩(wěn)定性、高水溶性和位點(diǎn)特異性。

此外,還有巰基炔與末端炔烴和環(huán)辛炔生物偶聯(lián)的再橋接技術(shù),其進(jìn)一步發(fā)展出新一代馬來(lái)酰亞胺,如二溴-(DBM)和二硫代馬來(lái)酰亞胺(DTM),用于位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。這些馬來(lái)酰亞胺類(lèi)似物在第3位和第4位含有良好的脫離基團(tuán),從而實(shí)現(xiàn)快速、高效和高產(chǎn)率的偶聯(lián)。最近報(bào)道了結(jié)合二溴和二硫代馬來(lái)酰亞胺性質(zhì)的雜化硫代溴馬來(lái)酰亞胺(TBM),這種TBM試劑結(jié)合更快,顯示出更高的DAR=4的百分比,這可能是由于溴減少了空間位阻。

2015年,Chudasama等人引入了一類(lèi)新的重橋接試劑,二溴吡啶二酮(dibromopyridazinediones)。他們證明了它能有效地插入到二硫鍵中,得到的結(jié)構(gòu)即使在高溫下也表現(xiàn)出了極好的水解穩(wěn)定性。然而,隨著還原步驟上的溫度升高,也觀(guān)察到不均一性,這種結(jié)構(gòu)也允許選擇性地引入不同的功能基團(tuán)。

二乙烯基嘧啶(Divinylpyrimidine)是另一種有效的重橋接試劑,能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的DAR=4的ADC。Spring等人研究了乙烯基雜芳基支架對(duì)半胱氨酸再橋接的作用,他們認(rèn)為用嘧啶取代吡啶可以使雜芳環(huán)成為更好的電子受體,從而提高交聯(lián)效率。他們的工作擴(kuò)展到二乙烯基三嗪,在高溫下,重橋接顯示出更高的效率。

為了避免與經(jīng)典馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)相關(guān)的體內(nèi)不穩(wěn)定性的缺點(diǎn),Barbas等人研究了甲基磺�；�苯基惡二唑,該試劑對(duì)半胱氨酸具有特異性反應(yīng)。與血漿中的半胱氨酸-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)物相比,他們的穩(wěn)定性更高。受此啟發(fā),Zeglis設(shè)計(jì)了DiPODS試劑,該試劑含有兩個(gè)通過(guò)苯基連接的惡二唑基甲基砜部分, DiPODS以重橋接的方式與兩個(gè)硫酸根形成共價(jià)鍵。與馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)相比,以這種方式偶聯(lián)具有優(yōu)越的體外穩(wěn)定性和體內(nèi)性能。

聚糖偶聯(lián)

由于IgG是一種糖蛋白,它在Fc片段每個(gè)重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域N297位置包含一個(gè)N-聚糖,這種糖基化可以作為連接有效載荷的附著點(diǎn)。多糖與Fab區(qū)域間遠(yuǎn)距離定位降低了在偶聯(lián)后損害抗體的抗原結(jié)合能力的風(fēng)險(xiǎn),此外,與抗體的肽鏈相比,它們的化學(xué)組成不同,允許位點(diǎn)特異性修飾,使它們成為合適的偶聯(lián)位點(diǎn)。

聚糖生物偶聯(lián)可根據(jù)用于靶向碳水化合物的技術(shù)來(lái)區(qū)分:包括聚糖代謝工程化、聚糖氧化后的糖轉(zhuǎn)移酶處理、內(nèi)糖苷酶和轉(zhuǎn)移酶處理后的酮或疊氮化物標(biāo)記。

Neri等人報(bào)道了在IgG抗體的N-糖基化位點(diǎn)處巖藻糖的位點(diǎn)特異性修飾。這種糖含有一個(gè)順式二醇部分,適合選擇性氧化。他們用偏高碘酸鈉氧化巖藻糖殘基,生成一個(gè)能夠與含聯(lián)氨的連接子反應(yīng)的醛基,這樣,抗體通過(guò)腙鍵與藥物相連。

Senter及其同事向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加硫基類(lèi)似物,通過(guò)代謝將6-硫代巖藻糖帶入抗體修飾。他們認(rèn)為,取代是通過(guò)劫持巖藻糖基化途徑來(lái)完成的,這樣就引入了化學(xué)位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性結(jié)合。與經(jīng)典半胱氨酸偶聯(lián)物相比,這種方法顯著降低了異質(zhì)性水平,并產(chǎn)生具有更可預(yù)測(cè)的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)特性的偶聯(lián)物。

重組IgG中很少含有唾液酸,然而,已經(jīng)證明,利用半乳糖基和唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以酶法改造甘氨酸。通過(guò)酶反應(yīng)添加半乳糖以獲得G2聚糖,然后添加末端唾液酸。這種修飾通過(guò)高碘酸氧化生成醛基,可以偶聯(lián)帶羥胺基團(tuán)的連接子-有效載荷。所得的偶聯(lián)物具有較高的靶向選擇性,體內(nèi)抗腫瘤活性良好。高碘酸還可氧化蛋氨酸等敏感氨基酸,影響與FcRn的結(jié)合。

除這些偶聯(lián)策略外,半乳糖殘基也可以作為修飾位點(diǎn)。多項(xiàng)研究報(bào)告了通過(guò)使用突變的β- 1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶,將半乳糖替換為一種含酮或疊氮官能團(tuán)的半乳糖,這種具有雙正交官能團(tuán)的半乳糖衍生物為高效偶聯(lián)開(kāi)辟了途徑。這些技術(shù)已被開(kāi)發(fā)用于成像和抗癌應(yīng)用。

從化膿性鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)糖苷酶EndoS和EndoS2,這些酶能夠水解IgG的N-聚糖,從而使水解后的殘基成為生物偶聯(lián)的有效位點(diǎn)。這種方法有助于使單抗的聚糖結(jié)構(gòu)均勻化,同時(shí)它也適用于任何IgG亞型。此類(lèi)方法應(yīng)用于trastuzumab-maytansine,制備出具有良好體外和體內(nèi)藥效的糖偶聯(lián)ADC。

2． 工程化抗體的位點(diǎn)特異性生物偶聯(lián)

生物正交化學(xué)和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的進(jìn)展有助于產(chǎn)生更均勻的ADC。盡管在天然單抗上有許多可用的附著方法可供選擇,但在工程化抗體上的位點(diǎn)特異性生物偶聯(lián)能夠更有效地控制DAR,并且避免改變與抗原結(jié)合的親和力。這樣,在某些位置加入天然或非天然氨基酸,得到具有優(yōu)良藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特征的同質(zhì)產(chǎn)品。

酶法

有效載荷的附著可以通過(guò)在抗體序列中插入特定的氨基酸標(biāo)簽以非常有選擇性的方式實(shí)現(xiàn)。這些標(biāo)簽被特定的酶所識(shí)別,例如甲酰甘氨酸生成酶(FGE)、微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MTG)、轉(zhuǎn)肽酶或酪氨酸酶,從而能夠執(zhí)行位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。

Aaron等人探索了一種新的利用醛標(biāo)記蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。該技術(shù)利用了基因編碼的五肽序列(Cys-X-Pro-X-Arg),其中半胱氨酸殘基被FGE識(shí)別,并在細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)期間被共翻譯氧化為甲酰甘氨酸。這樣,工程化抗體通過(guò)HIPS(hydrazino-Pictet–Spengler)化學(xué)方法與醛特異性連接子選擇性偶聯(lián)。

微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTGase)策略也經(jīng)常被開(kāi)發(fā)用于定位特異性偶聯(lián)。MTGase催化在脫糖抗體295位置的谷氨酰胺側(cè)鏈與底物的伯胺之間形成肽鍵。與其他酶策略相比,MTG是一種靈活的技術(shù),不需要肽供體來(lái)實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。只要酰基受體含有一種伯胺,就沒(méi)有結(jié)構(gòu)限制。

谷氨酰胺殘基自然存在于單抗的每個(gè)重鏈的Fc區(qū)域。在295位去糖基化后,谷氨酰胺殘基通過(guò)MTGase介導(dǎo)的反應(yīng)偶聯(lián),可以產(chǎn)生均一的DAR=2的ADC。為了提高效率,可以偶聯(lián)帶支鏈的連接子,從而使DAR翻倍,297位的天冬酰胺突變?yōu)楣劝滨０芬部稍黾覦AR。

NBE Therapeutics開(kāi)發(fā)了基于S金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的偶聯(lián)。他們的策略利用轉(zhuǎn)肽酶A(SrtA),在LPXTG(X=任何氨基酸)五肽的基序中切割蘇氨酸和甘氨酸殘基之間的酰胺鍵。然后,它催化甘氨酸相關(guān)的有效載荷與新生成的C-末端的偶聯(lián),在生理溫度和pH下生成肽鍵。

該方法應(yīng)用于不同抗體,如抗CD30和抗Her2,并使用含有5甘氨酸標(biāo)記的連接子偶聯(lián)maytansine和MMAE,兩種ADC均顯示出與經(jīng)典偶聯(lián)相似的體外細(xì)胞殺傷活性。酶法產(chǎn)生的trastuzumab-maytansine在體內(nèi)試驗(yàn)中完全匹配Kadcyla。

在另一個(gè)例子中,利用轉(zhuǎn)肽酶法生成了高效蒽環(huán)素毒素衍生物PNU-159682的ADC。有趣的是,通過(guò)這項(xiàng)技術(shù),偶聯(lián)效率甚至高于A(yíng)dcetris和Kadcyla類(lèi)似物。此外,所制備的PNU-159682 ADC具有較高的體外和體內(nèi)穩(wěn)定性,并且顯示出的效力超過(guò)了含有微管蛋白靶向有效載荷的ADC。

另一個(gè)新興的新方法是通過(guò)酪氨酸標(biāo)簽進(jìn)行位點(diǎn)特異性抗體標(biāo)記,酪氨酸標(biāo)簽與單克隆抗體輕鏈的C末端基因融合�？紤]到位點(diǎn)可及性,Bruins及其同事使用了一種工程化的四甘氨酰酪氨酸殘基作為標(biāo)記,它為偶聯(lián)提供了一個(gè)容易觸及的位點(diǎn)。酪氨酸酶將酪氨酸氧化成1,2-醌,從而允許與各種雙環(huán)[6．1．0]壬炔(BCN)衍生物的環(huán)加成反應(yīng)。這種方法可以與含有BCN連接子的MMAE有效地偶聯(lián)。

半胱氨酸工程:硫單抗技術(shù)

隨機(jī)半胱氨酸偶聯(lián)和重橋接是利用抗體結(jié)構(gòu)內(nèi)天然存在的半胱氨酸殘基的技術(shù)。然而,隨機(jī)半胱氨酸方法的異質(zhì)性以及重橋接策略中的單抗片段化需要在A(yíng)DC合成中加以考慮,特別是當(dāng)疏水性藥物被偶聯(lián)時(shí)。

與它們不同的是,硫單抗技術(shù)通過(guò)利用不涉及結(jié)構(gòu)二硫鍵的工程化反應(yīng)性半胱氨酸,在抗體上實(shí)現(xiàn)所需位點(diǎn)的選擇性和均勻修飾。一般來(lái)說(shuō),半胱氨酸突變的設(shè)計(jì)是為了促進(jìn)細(xì)胞毒性有效載荷偶聯(lián)的同時(shí),保持單克隆抗體的穩(wěn)定性、親和力和最小化ADC聚集。為了確定突變的最佳位置,通常采用幾種技術(shù),包括計(jì)算建模、模型系統(tǒng)篩選和高通量掃描。

Junutula等人首先報(bào)道了一種硫單抗策略,用工程化半胱氨酸殘基取代了抗MUC16抗體重鏈114位的丙氨酸(HC-A114),工程化位置內(nèi)的反應(yīng)性硫醇能夠與馬來(lái)酰亞胺負(fù)載的連接子反應(yīng)。合成的抗MUC16 ADC在異種移植小鼠模型中表現(xiàn)出效力,在大鼠和食蟹猴中表現(xiàn)出高劑量耐受性,這個(gè)發(fā)現(xiàn)建立了硫單抗偶聯(lián)策略的一般性方法。

此外,琥珀酰亞胺連接在胞漿內(nèi)可以經(jīng)歷兩個(gè)平行反應(yīng):反向Michael反應(yīng)導(dǎo)致連接子-有效載荷的損失,以及琥珀酰亞胺的水解,這兩種反應(yīng)都對(duì)體內(nèi)ADC活性有顯著影響。為了提高穩(wěn)定性,Lyon和合作者設(shè)計(jì)了一個(gè)與馬來(lái)酰亞胺相鄰的堿性氨基整合進(jìn)來(lái)的連接子。在連接子中加入二氨基丙酸(DPR)促進(jìn)了硫琥珀酰亞胺在中性pH和室溫下的快速定量水解,這樣,非特異性的去偶聯(lián)作用被阻止,從而提高了體內(nèi)的穩(wěn)定性。除了常用的馬來(lái)酰亞胺外,還探索了不同的半胱氨酸反應(yīng)劑,如碘乙酰胺、溴甲酰胺、羰基丙烯酸酯,N-烷基乙烯基吡啶鹽。

3． 與工程化非天然氨基酸的生物偶聯(lián)

除了硫單抗技術(shù)外,非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(ncAA)的加入為位點(diǎn)特異性偶聯(lián)提供了另一種可能性。該技術(shù)使用含有獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)的氨基酸,從而能夠以化學(xué)選擇性的方式引入連接子-有效載荷復(fù)合物。該技術(shù)需要對(duì)抗體序列重組,利用與宿主細(xì)胞內(nèi)所有內(nèi)源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶(aaRS),用于響應(yīng)未賦值密碼子將ncAA帶入蛋白質(zhì)。通常,ncAA在發(fā)酵過(guò)程中被添加到培養(yǎng)基中。選擇非天然氨基酸是很重要的,因?yàn)樗鼈兛赡芗ぐl(fā)免疫原性。常用的ncAA是具有獨(dú)特基團(tuán)的天然氨基酸的類(lèi)似物,如酮、疊氮、環(huán)丙烯或二烯。

已有研究將對(duì)乙酰苯丙氨酸(pAcF)成功地整合入抗CXCR4 抗體中。有效載荷Auristin通過(guò)肟連接與抗體有效偶聯(lián),從而生成化學(xué)均一的ADC。該ADC在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的體外活性和完全清除肺腫瘤的作用。

由于肟連接所需的酸性條件和ADC緩慢釋放的動(dòng)力學(xué),另一種選擇是加入含ncAA的疊氮化物。廣泛應(yīng)用的對(duì)疊氮哌苯胺(pAzF)可在生理?xiàng)l件下快速進(jìn)行CuAAC或SPAAC反應(yīng),利用這種策略成功地在抗CD74抗體上偶聯(lián)糖皮質(zhì)激素有效載荷。除了pAcF技術(shù)外,還成功地將含疊氮的賴(lài)氨酸類(lèi)似物(AzK)帶入到抗體中,以產(chǎn)生具有Auristin、PBD二聚體或微管蛋白有效載荷的位點(diǎn)特異性ADC。

此外,賴(lài)氨酸的環(huán)丙烯衍生物(CypK)以及自然發(fā)生的非典型氨基酸,如硒代半胱氨酸(Sec)都成功地整合進(jìn)入抗體中。所產(chǎn)生的ADC表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性、選擇性以及體外和體內(nèi)活性。

ADC的相關(guān)內(nèi)吞途徑

一般來(lái)說(shuō),正常的內(nèi)吞作用可分為三個(gè)階段:(1)芽的形成,(2)膜的彎曲和囊泡的成熟,(3)膜的斷裂并釋放到細(xì)胞質(zhì)中。多種內(nèi)吞途徑有重疊的方面,因此內(nèi)吞的一般過(guò)程是高度靈活和復(fù)雜的。

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(CME)在概念上是一個(gè)簡(jiǎn)單的過(guò)程,包括幾個(gè)連續(xù)和部分重疊的步驟。CME可由質(zhì)膜上的某些受體結(jié)構(gòu)性啟動(dòng),或者需要配體和/或抗體結(jié)合后啟動(dòng)。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中的內(nèi)吞衣殼蛋白開(kāi)始聚集在質(zhì)膜的內(nèi)小葉上時(shí),CME就開(kāi)始了。衣殼蛋白通過(guò)從細(xì)胞質(zhì)中招募并與額外的蛋白質(zhì)適配器相互作用而繼續(xù)組裝和生長(zhǎng)。關(guān)鍵的銜接蛋白使膜彎曲,從而將內(nèi)化受體/配體集中到一個(gè)“網(wǎng)格蛋白包被坑”(CCP)中。由于CCP內(nèi)陷增大,CCP頸縮窄時(shí),通過(guò)一個(gè)斷裂過(guò)程與質(zhì)膜分離。肌動(dòng)蛋白聚合有助于將CCP向內(nèi)拉入細(xì)胞質(zhì),直到斷裂完成,CCP釋放并成為一個(gè)網(wǎng)格蛋白包被的囊泡(CCV)。最后,CCV外殼被分解,CCV與內(nèi)涵體融合以運(yùn)輸?shù)教囟ǖ膩喖?xì)胞位置,或者可以被回收回細(xì)胞表面。  

網(wǎng)格蛋白是CME的關(guān)鍵成分,由重鏈和輕鏈組成。三個(gè)網(wǎng)格蛋白重鏈和輕鏈形成一個(gè)三聚體,它與其他三聚體相互作用,并在新興的CCP周?chē)�形成一個(gè)多邊形晶格。銜接蛋白2(AP-2)是一種異源四聚體復(fù)合物,它介導(dǎo)CCP頸部的收縮。Dynamin是一種GTP酶,在成熟囊泡的頸部形成螺旋狀聚合物。GTP水解后,dynamin誘導(dǎo)囊泡從質(zhì)膜分裂。

小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用

不依賴(lài)于網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用包括小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、小窩蛋白非依賴(lài)性載體蛋白/GPI-富集的早期內(nèi)區(qū)室(CLIC/GEEC)和巨胞飲作用。

小窩是質(zhì)膜的小瓶狀內(nèi)陷,其特征是高水平的膽固醇和鞘糖脂,通過(guò)不依賴(lài)于網(wǎng)格蛋白的途徑介導(dǎo)內(nèi)吞作用,并且存在于大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型中。小窩的主要支架蛋白是小窩蛋白,它是形成寡聚體的20–24 kDa完整膜蛋白。小窩蛋白共享共同的支架結(jié)構(gòu)域,這些支架結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)與自身和其他包含小窩蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的相互作用。

雖然小窩具有類(lèi)似CCPs的內(nèi)陷形態(tài),但它們是不同的。簡(jiǎn)單地說(shuō),CCP的密度是恒定的,而小窩的密度會(huì)因細(xì)胞類(lèi)型的不同而變化很大。CCPs隨著萌發(fā)的內(nèi)體成熟而增大,相比之下,小窩囊泡保持不變的大小。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),小窩就形成了高階結(jié)構(gòu),而不是由CCPs形成的簡(jiǎn)單的球形內(nèi)體。

小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的另一個(gè)獨(dú)特方面是,只有約1%的小窩是從質(zhì)膜上萌發(fā)的。在一小部分內(nèi)化的小窩中,它似乎遵循一條與Rab5(早期內(nèi)胚體的標(biāo)志物)共定位的循環(huán)途徑。這可能對(duì)以利用小窩蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞作用的受體為靶點(diǎn)的ADC帶來(lái)挑戰(zhàn)。

CLIC/GEEC內(nèi)吞作用

CLIC/GEEC是一種內(nèi)吞室,主要發(fā)生在配體激活的細(xì)胞中,這可能由生長(zhǎng)因子、抗體的受體交聯(lián)或細(xì)菌毒素和病毒引起。此外,細(xì)胞膜必須處于高流動(dòng)性狀態(tài),因?yàn)镃LIC/GEEC在低于生理溫度或膜處于更高張力的情況下不起作用。

CLIC在遷移細(xì)胞的前緣增加。識(shí)別CLIC/GEEC途徑的其他相關(guān)參數(shù)包括動(dòng)力非依賴(lài)性質(zhì)膜斷裂、對(duì)膽固醇消耗的敏感性、Rab5/與早期內(nèi)體融合的獲得、胎盤(pán)堿性磷酸酶(PLAP)和與FAK相關(guān)的GTPase調(diào)節(jié)因子(GRAF1)。

巨胞飲作用

巨胞飲作用是一種更大規(guī)模的內(nèi)吞作用形式,通常涉及質(zhì)膜高度皺折的區(qū)域/突起,這些區(qū)域/突起隨后相互融合或與質(zhì)膜融合。膜皺褶是巨胞飲作用的形態(tài)學(xué)特征。

巨胞飲作用依賴(lài)于肌動(dòng)蛋白聚合、Rac1蛋白和p21活化激酶1(PAK1)。PAK1是一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子,因?yàn)樗�與Rac1相互作用,Rac1激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、Ras、Src和Hsp90,以促進(jìn)巨胞飲作用。巨胞飲作用也是膽固醇依賴(lài)性的,這是招募Rac1所必需的。這些成分最終導(dǎo)致比CME和小窩蛋白更大吸收面積的內(nèi)吞作用。

ADC靶向抗原的內(nèi)吞特性

CD33

CD33是一種67kda跨膜糖蛋白受體,通常在正常髓系細(xì)胞上表達(dá),由于其在A(yíng)ML細(xì)胞上優(yōu)先過(guò)表達(dá),是GO的靶點(diǎn)。CD33的胞內(nèi)免疫受體酪氨酸基抑制基序(ITIM)調(diào)節(jié)CD33的內(nèi)吞作用,可通過(guò)CME激活內(nèi)吞作用。關(guān)于內(nèi)吞效率,AML細(xì)胞中CD33的表達(dá)水平與其內(nèi)吞率之間沒(méi)有相關(guān)性。CD33是一種緩慢內(nèi)化的抗原,此外,CD33交聯(lián)并不能改善內(nèi)吞作用。對(duì)GO無(wú)響應(yīng)的AML患者可能與CD33受體內(nèi)吞的功能低下有關(guān)。

CD30

CD30是一種120kda跨膜糖蛋白,屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族。其細(xì)胞外部分由六個(gè)擴(kuò)展構(gòu)象的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)組成。CD30在活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞以及各種淋巴腫瘤(包括霍奇金淋巴瘤和ALCL)上表達(dá)。

CD30不具有內(nèi)吞作用,相反,它因蛋白水解裂解而脫落,CD30的脫落由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)介導(dǎo)。脫落是CD30生物學(xué)的一個(gè)特征,高濃度的循環(huán)可溶性CD30可以作為監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展的血清標(biāo)志物。對(duì)于A(yíng)DC的療效,升高的CD30循環(huán)水平似乎會(huì)隔離注射的ADC,從而減少能夠定位于CD30陽(yáng)性腫瘤部位的ADC的數(shù)量。因此,缺乏內(nèi)吞作用的結(jié)果表明CD30不是理想的ADC靶點(diǎn)。

CD22

CD22是一種140 kDa的跨膜糖蛋白,與CD33一樣,它也是Siglec家族的成員,并與該家族共享多種結(jié)構(gòu)特征。關(guān)鍵的區(qū)別在于CD22比CD33大得多,因?yàn)樗�有多個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域和ITIM/ITIM樣基序。CD22的表達(dá)僅限于B細(xì)胞,CD22在各種B細(xì)胞惡性腫瘤(包括ALL)的大多數(shù)母細(xì)胞中表達(dá)水平升高。

CD22通過(guò)CME進(jìn)行內(nèi)吞作用。類(lèi)天然配體通過(guò)CD22的結(jié)構(gòu)性快速內(nèi)吞在細(xì)胞內(nèi)積聚。這些配體在溶酶體中被分類(lèi)降解,而CD22則循環(huán)回到細(xì)胞表面。此外,CD22配體誘導(dǎo)的內(nèi)吞激活細(xì)胞內(nèi)池,補(bǔ)充或增加細(xì)胞表面CD22的表達(dá)水平。因此,CD22對(duì)ADC具有良好的內(nèi)吞特性。

CD79b

CD79b僅在未成熟和成熟的B細(xì)胞中表達(dá),在惡性腫瘤≥80%的B細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。CD79a和CD79b是兩種非共價(jià)結(jié)合的跨膜蛋白,介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)和內(nèi)吞作用。對(duì)于后者,CD79a-CD79b異二聚體是控制BCR內(nèi)吞的支架。BCR內(nèi)吞作用主要由CME完成,并由AP-2介導(dǎo)。有趣的是,CD79a直接與AP-2的μ亞單位相互作用,進(jìn)而激活CD79b并導(dǎo)致整個(gè)BCR復(fù)合物的內(nèi)吞。

此外,對(duì)于A(yíng)DC來(lái)說(shuō),CD79a可以作為單體內(nèi)化,但CD79b卻不能。如果CD79b的近端膜酪氨酸(Y195)發(fā)生突變,AP-2與CD79a的結(jié)合就會(huì)被阻斷,內(nèi)吞也被阻斷。在18%的活化B細(xì)胞樣DLBCL標(biāo)本中,Y195發(fā)生突變�？傊�,有證據(jù)表明CD79b其內(nèi)吞活性依賴(lài)于整個(gè)BCR復(fù)合體的內(nèi)化,而不是作為單體的內(nèi)化。

TROP-2

Trop2是一種46kDa的單體糖蛋白,具有選擇性過(guò)度表達(dá)、結(jié)構(gòu)性?xún)?nèi)吞作用和導(dǎo)向溶酶體等特性,使其成為ADC的一個(gè)非常有吸引力的靶點(diǎn)。Trop2的內(nèi)化機(jī)制與CME有關(guān)。

觀(guān)察到的Trop2強(qiáng)大的內(nèi)吞作用,一種潛在的解釋可能是由于顯著的Trop2聚集。研究Trop2的構(gòu)象動(dòng)力學(xué),發(fā)現(xiàn)Trop2通過(guò)位于跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸“VVVVV”組成的相互作用片段形成天然的同型二聚體。Trop2的二聚作用可以通過(guò)其他細(xì)胞表面蛋白質(zhì)進(jìn)一步將Trop2單體招募到更接近的位置。因此,Trop2簇很可能由多個(gè)二聚體通過(guò)脂筏和其他膜結(jié)合蛋白連接而成。

Trop2與多種配體結(jié)合,如claudin-1、claudin-7、cyclin D1和IGF1,然而,這些配體都沒(méi)有證明在與Trop2結(jié)合或相互作用時(shí)被內(nèi)化。因此,與正常細(xì)胞相比,Trop2在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生的內(nèi)吞作用更為強(qiáng)烈,這些都表明Trop2是ADC的一個(gè)很好的靶點(diǎn)。

BCMA

BCMA或CD269,也稱(chēng)為T(mén)NFR超家族成員17,轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)B細(xì)胞存活和增殖的信號(hào)。BCMA的分子量?jī)H為20．2 kDa,其配體結(jié)合的胞外區(qū)域具有“臂椅”構(gòu)象,由六個(gè)CRD組成。除了多發(fā)性骨髓瘤外,BCMA還表達(dá)于許多血液系統(tǒng)惡性腫瘤,如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。

然而,關(guān)于BCMA所利用的精確內(nèi)吞途徑的知之甚少。與內(nèi)吞作用有關(guān),唾液酸化是一種調(diào)節(jié)功能,它可能誘導(dǎo)BCMA利用CME發(fā)生內(nèi)吞作用。

HER2

HER2是一種185kda跨膜糖蛋白,屬于EGFR家族。HER2/neu基因的擴(kuò)增是已知的人類(lèi)惡性腫瘤和轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)因素。由于HER2在癌癥中的作用,幾十年來(lái)一直被作為治療靶點(diǎn)。HER2也一直是ADCs的靶點(diǎn),T-DM1和T-DXT都被批準(zhǔn)用于HER2陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。

HER2的內(nèi)吞存在多種機(jī)制,首先是CME,共免疫沉淀清楚的顯示HER2直接與AP-2結(jié)合,此外,dynasore能完全阻斷SKBR3細(xì)胞的HER2內(nèi)吞作用;其次小窩蛋白結(jié)合基序φxφxxxxφ(φ代表芳香族氨基酸Trp、Phe或Tyr)通常存在于小窩蛋白相關(guān)蛋白上,有趣的是,序列WSYGVTIW已在HER2的細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域中被鑒定出;另外,有研究證明HER2可以利用CLIC/GEEC的內(nèi)吞途徑。

這些不同的發(fā)現(xiàn)揭示了HER2內(nèi)吞的重要特征。首先,HER2的內(nèi)吞作用是混雜的,其次,小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑似乎更常被利用。

Nectin-4

Nectin-4是一種66 kDa 的I型跨膜蛋白,其主要作用是促進(jìn)細(xì)胞間的接觸。Nectin-4作為ADC靶點(diǎn)很有吸引力,因?yàn)檠芯勘砻?它在幾種腫瘤類(lèi)型中過(guò)表達(dá),但在正常成人組織中幾乎不存在。

目前,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)天然配體或mAb/ADC與nectin-4的復(fù)合物內(nèi)吞的信息,但是可以借鑒nectin-4結(jié)合病原體內(nèi)吞的研究。Nectin-4也是麻疹病毒的受體,研究表明,麻疹病毒通過(guò)巨胞飲作用進(jìn)入MCF7、HTB-20乳腺癌和DLD-1結(jié)直腸癌細(xì)胞。病毒進(jìn)入需要PAK1,相反,dynamin抑制劑Dynasore對(duì)病毒進(jìn)入沒(méi)有影響。此外,表達(dá)顯性負(fù)性小窩蛋白的細(xì)胞并不能消除病毒的內(nèi)吞作用。

基于這些間接研究,nectin-4表現(xiàn)出病毒受體所需的強(qiáng)大的內(nèi)吞活性。

ADC的臨床開(kāi)發(fā)概況

目前,ADC藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域持續(xù)火熱,有效載荷,連接子和偶聯(lián)技術(shù)的快速發(fā)展使ADC具有更高的均勻性、穩(wěn)定性和生成效率。這為臨床上的ADC藥物開(kāi)發(fā)提供了燃料,下面3個(gè)表格按照“小分子、生物大分子和放射性同位素”的分類(lèi)總結(jié)了截至2021年2月處于臨床開(kāi)發(fā)后期中的ADC。

小結(jié)

盡管第一個(gè)ADC在20多年前就獲得了FDA的首次批準(zhǔn),但制藥行業(yè)必須經(jīng)歷一個(gè)漫長(zhǎng)且乏味的學(xué)習(xí)過(guò)程,才能在市場(chǎng)和臨床開(kāi)發(fā)中獲得一條穩(wěn)定的ADC管線(xiàn)。盡管目前已有11種已批準(zhǔn)的ADC,但是由于A(yíng)DC的技術(shù)進(jìn)步,該領(lǐng)域正在經(jīng)歷一次爆發(fā),我們?cè)谟行лd荷,連接子和偶聯(lián)技術(shù)方面獲得了多個(gè)突破,進(jìn)一步加深了對(duì)ADC這種新型藥物的全面認(rèn)識(shí)。

此外,藥物劑量-暴露-效應(yīng)關(guān)系的確定是ADC成功的關(guān)鍵,內(nèi)吞作用是這種關(guān)系的關(guān)鍵部分,對(duì)于優(yōu)化給藥方案以最大限度地提高治療指數(shù)非常重要。然而盡管目前ADC領(lǐng)域如火如荼,但是我們對(duì)靶受體的內(nèi)吞作用仍知之甚少。另外,許多內(nèi)吞作用的核心成分和關(guān)鍵的效應(yīng)器非常重要,然而這些蛋白可能在癌癥中普遍發(fā)生突變,這也會(huì)影響ADC內(nèi)吞作用和療效。相信隨著該領(lǐng)域的發(fā)展,經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)次積累的經(jīng)驗(yàn),ADC終會(huì)迎來(lái)真正的春天。

參考文獻(xiàn):

1．The Chemistry Behind ADCs． Pharmaceuticals (Basel)． 2021 May; 14(5): 442．