3． 創(chuàng)新藥物

凋亡誘導劑（Bcl－xL抑制劑）

抗凋亡Bcl－2家族成員（包括Bcl－xL）的過度表達是癌細胞獲得凋亡抵抗的機制之一。能夠阻斷Bcl－xL上BH3結合域的藥物可以觸發(fā)癌細胞凋亡。2017年，AbbVie首次以ADC的形式展示了BcL－xL抑制劑的有效載荷，其靶向表達EGFR的特定細胞或組織。有趣的是，研究人員在有效載荷上使用了三個不同的連接點來連接可切割的連接子。氨基烷基延伸的核心修飾用于在需要時建立合適的連接位點。

泰蘭司他丁及其類似物

靶向剪接體是一種參與mRNA加工的大型核糖核蛋白復合物，為靶向癌癥治療提供了一種有希望的治療選擇。有幾種天然產(chǎn)物能夠通過與不同的剪接體亞單位結合來抑制RNA剪接。最具代表性的是thailanstatin A，它可以與剪接體的SF3b亞單位結合，從而阻止RNA剪接。

Thailanstatin A缺乏一個適合連接連接子的基團。為了解決這個問題，將羧酸與乙二胺偶聯(lián)以引入含有胺的間隔基，該間隔基通常用于連接子的安裝。

將這種天然產(chǎn)物用于ADC的另一個困難是存在多種反應性功能。例如，中心核中的二烯可以通過Diels–Alder反應與用于生物結合的馬來酰亞胺部分反應。這個問題是通過使用另一個共軛部分，鹵代乙酰胺來解決的。結合這兩種修飾并包含可切割連接子的ADC首次在專利文獻中報道，并且聲稱它們在幾個表達HER2的細胞系中具有適度的活性。

最近，輝瑞報告說，羧酸直接與抗體的有效表面賴氨酸（無連接子偶聯(lián)）結合導致迄今為止最有效的Thailanstatin ADC。這些賴氨酸偶聯(lián)物的活性與藥物負載有關，而其他有效載荷類通常沒有觀察到這種特性。ADCs在胃癌異種移植模型中顯示出良好的作用。

鵝膏毒素

在ADC技術領域，使用類似amatoxins的轉錄抑制劑是一種相對較新的方法。九種天然存在的amatoxin衍生物具有相同的骨架結構，一個由八個L－構型氨基酸組成的大環(huán)，通過亞砜部分連接在色氨酸和半胱氨酸殘基之間。amatoxins的三個側鏈是羥基化的，OH基團具有良好的水溶性并與目標分子結合。兩種肽，α－鵝膏糖蛋白和β－鵝膏毒素，占所有毒素的90％。

在amatoxins上共使用過三個附著點產(chǎn)生ADC。第一次嘗試是將β－鵝膏毒素的羧基偶聯(lián)到IgG上賴氨酸的氨基，這種連接具有良好的血漿穩(wěn)定性和高細胞毒性，但這種生物偶聯(lián)的產(chǎn)率很低。二氫異亮氨酸的羥基也被認為是一個連接點，引入谷胱甘肽作為連接子，然后通過賴氨酸結合，可獲得體外細胞毒性和體內抗腫瘤活性優(yōu)異的ADC，但不幸的是，由于血清羧酸酯酶裂解連接子，導致其循環(huán)穩(wěn)定性差。第三種方法，附著于色氨酸的6－羥基代表了目前的標準程序，苯酚與各種連接子的醚化導致了高度穩(wěn)定和有效的ADC。由于鵝膏毒素其它氨基酸要么不具化學活性，要么是與RNA聚合酶II結合的關鍵，因此不能將其它的鵝膏毒素氨基酸（即羥脯氨酸、甘氨酸、異亮氨酸和半胱氨酸）用于偶聯(lián)。

基于amanitin的代表性的ADC為HDP－101。有效載荷本身是一種合成的金剛烷醇衍生物，優(yōu)化了穩(wěn)定性。與天然天麻素相比，兩個差異是色氨酸中沒有6′－OH，硫醚鏈取代亞砜。通過天冬氨酸側鏈上酰胺的形成，引入組織蛋白酶B－裂解連接子。

最近，Park及其合作者為含苯酚的有效載荷設計了一種新的連接基序（OHPAS）。它是一種二芳基硫酸鹽，一個芳基部分來自有效載荷，另一個來自連接基序的潛在苯酚基團。將該技術應用于曲妥珠單抗ADC中的a－鵝膏毒素，在體外和體內表現(xiàn)出強大的細胞毒性。

煙酰胺磷酸核糖轉移酶

煙酰胺磷酸核糖基轉移酶（NAMPT）是一種負責將煙酰胺轉化為煙酰胺單核苷酸的酶，其抑制劑在各種臨床前和臨床研究中顯示出有效性，但其臨床應用受到靶向毒性和劑量限制性毒性的限制，如血小板減少和胃腸道不良反應。

諾華公司的研究人員在NAMPT抑制劑有效載荷中的苯環(huán)對位中引入哌嗪部分，確定了合適的連接子附著點。這種分子在c－Kit和HER2表達細胞系上表現(xiàn)出納摩爾水平的效力，并且耐受性良好，在體內表現(xiàn)出靶向依賴性。

卡馬霉素

從庫拉索菌中分離得到兩種新的蛋白酶抑制劑，卡馬霉素A和卡馬霉素B。兩者都具有亮氨酸衍生的α，β－環(huán)氧酮彈頭直接連接到甲硫氨酸亞砜或甲硫氨酸砜。他們被發(fā)現(xiàn)能抑制釀酒酵母20S蛋白酶β5亞單位活性（糜蛋白酶樣活性）。此外，它們對肺癌和結腸癌細胞株具有很強的細胞毒性。

然而，由于它們的高效價，它們的選擇性較差，經(jīng)常表現(xiàn)出毒副作用。因此，劇毒的卡馬霉素衍生物適合作為ADC的彈頭，可以保持所需的效力，并獲得更好的耐受性。所設計的類似物均在P2位置并入砜甲硫氨酸衍生物（如卡馬霉素B），而不是卡馬霉素A中的亞砜甲硫氨酸，因為這消除了亞砜基立體異構體混合物產(chǎn)生的結構復雜性。

第一代類似物在P4末端含有胺基，不幸的是，這個附著點并不合適，因為有效載荷顯示細胞毒性活性降低。第二代卡馬霉素類似物在P2側鏈上含有一個胺基，當短乙基氨基鏈延伸磺�；鶗r，效果最好。在第三代類似物中，芳基連接砜和胺，因此降低了它的堿性。第二代和第三代有效載荷都顯示出強大的體外活性，并用可切割或不可切割的連接子連接。不幸的是，沒有一種ADC對受試癌細胞系表現(xiàn)出比曲妥珠單抗更高的細胞殺傷能力。

連接子

連接子不僅是抗體與小分子有效載荷之間形成共價連接的分子部分，而且是靶向藥物治療中具有設計性質的關鍵元件。連接子的加入不應誘導聚集，并且需要確�？山邮艿腜K特性，同時限制有效載荷在血漿中的過早釋放（穩(wěn)定性），并使活性分子在靶向作用位點有效釋放。連接子分為兩類：不可切割型和可切割型。

1． 不可切割連接子

基于不可切割的連接子的ADC必須被內化，抗體部分需要被溶酶體蛋白酶降解以釋放活性分子。在ADC開發(fā)過程中已經(jīng)探索了許多不可切割的連接子，最具代表性的是N－琥珀酰亞胺基－4－（N－馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷－1－羧酸鹽（SMCC），Kadcyla就是使用的此類型連接子。

這種結構的分解代謝導致Lys－SMC－DM1成為主要的腫瘤代謝物。此外，與這種連接子相連的藥物通常不能發(fā)揮旁觀者效應，因為釋放的分解代謝產(chǎn)物通透性較差。目前的研究主要集中在可切割的連接子上。

使用可切割連接子對于具內化和不具內化ADC的設計同樣可行，因為釋放是由切割位點（溶酶體和／或腫瘤環(huán)境）的性質觸發(fā)的。連接子可以分為兩大類：酶依賴性和化學（即非酶）依賴性。

2． 化學依賴性連接子

含有二硫鍵的連接子受到硫醇的親核攻擊以釋放活性載荷。盡管血漿中人血清白蛋白（HSA）的還原形式就是最豐富的硫醇，但它對大分子的反應性很差。胞漿中還含有高水平的谷胱甘肽（GSH），這是一種含有巰基的三肽，很容易與S－親核蛋白發(fā)生反應。血液（微摩爾范圍）和細胞質（毫摩爾范圍）中GSH濃度的差異以及癌細胞引起的氧化應激有助于藥物在癌細胞內的優(yōu)先釋放。含有二硫鍵的連接子主要與maytansinoid類有效載荷相關。二硫鍵的反應性可由空間位阻調節(jié)：α－甲基替換顯著影響還原速率和對硫醇－二硫鍵交換的抗性，如SAR－3419的連接子通過偕二甲基替換獲得SPDB－DM4最佳的抗腫瘤活性。

腙連接子顯示出依賴于pH的穩(wěn)定性，在中性pH下穩(wěn)定，并在酸性介質中水解（內體的pH＜6，溶酶體的pH＜5），形成相應的酮和肼。

該方法已成功應用于IMMU－110，包含一個可裂解酰基腙連接子，由4－馬來酰亞胺甲基環(huán)己烷－1－羧酸鹽（MCC）的酰肼與阿霉素中存在的酮基反應中形成。

腙連接體也經(jīng)常用于卡利霉素家族的有效載荷，在這種情況下，釋放是由兩步活化過程觸發(fā)的：第一步酸敏感腙被水解，第二步二硫鍵被GSH還原，使巰基中間體環(huán)化。這種連接子已經(jīng)在上市的Mylotarg和Besponsa中使用，但是它們在血漿中的穩(wěn)定性不如預期，也不如其他可切割連接子吸引人。

3． 酶依賴性連接子

為了限制有效載荷在內化前的釋放，從而防止或最小化目標細胞外的降解，溶酶體的蛋白質組分成為尋找能夠降解ADC并以高濃度存在的酶的合理場所。

組織蛋白酶－B

組織蛋白酶B是一種半胱氨酸蛋白酶，存在于哺乳動物的晚期內體和溶酶體中，在許多癌細胞中也過度表達。最初，一種可切割的二肽作為組織蛋白酶B的底物用作阿霉素前藥，這項工作建立了SAR的二肽部分：P1位置需要親水性殘基（瓜氨酸或精氨酸），而P2位置的親脂性殘基增強血漿穩(wěn)定性（苯丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸）。

此外，還引入了一個自降解間隔子來促進酶的進入，從而限制了有效載荷的空間位阻：對氨基芐基氨基甲酸酯（PABA）在酸性介質中自發(fā)1，6－消除，釋放二氧化碳、對氮雜醌甲酰胺和阿霉素。最終，這一發(fā)現(xiàn)從前藥轉移到ADC領域，證明了Val－Cit和Phe－Lys二肽連接子的抗原驅動的細胞活性。

Val－Cit二肽是ADCs中最常用的可裂解連接子，目前有多達25個分子處于臨床階段，可能是因為其整體良好的血漿穩(wěn)定性、釋放行為和化學可牽引性。兩個已獲批的ADC藥物（Adcetris和Polivy） 都使用了相同的連接子mc－VC－PABC，其中包含馬來酰亞胺基間隔子、作為組織蛋白酶底物的標準Val Cit二肽序列和PABC自降解間隔子。

Val－Ala二肽也被廣泛應用，有7個分子處于臨床階段，進展最快的是Loncastuximab tesirine，其包括一個聚乙二醇化間隔子，以平衡屬于PBD二聚體家族的有效載荷SG3199的親脂性。

研究表明，由于沉淀和聚集，Val－Cit很難實現(xiàn)高DAR。相反，Val－Ala連接子允許DAR高達7．4，且聚集有限（＜10％）。與Val－Cit相比，Val－Ala的疏水性較低，這解釋了為什么這種連接子在親脂性的有效載荷（如PBD二聚體）方面表現(xiàn)卓越，7個臨床候選ADC的Val－Ala連接子都連接PBD。

一些研究將Val－Cit和Val－Ala二肽結構與MMAE的有效載荷連接進行了比較。在非內化抗體的情況下，結合到工程化半胱氨酸的Val－Cit和Val－Ala連接子都表現(xiàn)出類似的特征，并且比Val－Lys和Val－Arg類似物表現(xiàn)出更好的性能。在使用隨機半胱氨酸結合的抗Her2 ADC的情況下，與Val－Cit相比，Val－Ala在高DAR結構中顯示出較少的聚集性。另一方面，兩種連接子顯示出相似的緩沖穩(wěn)定性、組織蛋白酶B釋放效率、細胞活性和組織病理學特征。

四肽Gly－Gly－Phe－Gly顯示出穩(wěn)定和有效的可切割連接子的所有特性，已上市的ADC藥物Enhertu使用了此類連接子。第一三共的Enhertu是一種血漿穩(wěn)定的ADC，DAR為7．7，在溶酶體中發(fā)生蛋白酶降解，釋放DX－8951f，這是一種有效的拓撲異構酶I抑制劑，來源于exatecan。由于連接子不含增溶劑，達到如此高的DAR是非�？捎^的，因為它與廣泛確立的原理相矛盾，即高DAR結合物可能具有較差的藥代動力學特征。這里使用的自降解間隔子是簡單和緊湊的半胺化，而不是Val－Cit連接子使用的PABC。

磷酸酶和焦磷酸酶

與組織蛋白酶一樣，焦磷酸酶和磷酸酶也是在溶酶體中選擇性表達的水解酶。2016年，默克公司的研究人員設計了含有磷酸和焦磷酸的連接子與組織蛋白酶B敏感的Val－Cit－PABA搭配，旨在傳遞糖皮質激素：磷酸鹽／焦磷酸鹽部分結合在自降解間隔子PABA和有效載荷之間。內化后，有效載荷可通過組織蛋白酶B、自降解間隔子和磷酸酶（n＝1）的順序釋放。對于焦磷酸酯（n＝2），可能需要另一個涉及焦磷酸酶的步驟。

這種親水性和永久性帶電基團的優(yōu)點是溶解性，不僅能夠與親脂性糖皮質激素衍生物進行生物偶聯(lián)，而且促進ADC純化， ADC中的殘余連接子少于0．10％。含有磷酸和焦磷酸的ADC在體外都具有活性。

默克公司的同一組研究人員還開發(fā)了一種獨特的基于焦磷酸酶的連接子，用于釋放含羥基有效載荷地塞米松和丙酸氟替卡松。

此外，羥基附著點的性質對有效釋放至關重要。地塞米松的伯醇效果良好，而更受阻的氟替卡松的仲醇需要一個縮醛間隔子，從而實現(xiàn)可接受的釋放。兩種ADC在體外均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，對腫瘤細胞系具有較強的活性。

β－葡萄糖醛酸酶

β－葡萄糖醛酸酶是一類糖苷酶，催化β－葡萄糖醛酸殘基的水解，它在溶酶體和腫瘤間質中高表達。西雅圖遺傳學的研究人員于2006年發(fā)表了一項開創(chuàng)性的工作，抗CD70 ADC使用了含葡萄糖醛酸的連接子，葡萄糖醛酸附著在自降解間隔子上。這種連接子表現(xiàn)出低水平的聚集、高血漿穩(wěn)定性、以及強大的體內功效。

該連接子還通過一個額外的二甲基乙二胺（DMED）自降解間隔子應用于其他含胺的有效載荷，如喜樹堿類似物、SN38、杜卡霉素和苦參堿。釋放順序從水解β－葡萄糖醛酸到自降解間隔子，DMED的另一個環(huán)化反應自發(fā)發(fā)生，形成1，3－二甲基咪唑啉－2－酮，并最終釋放含羥基藥物。由于連接子的親水性，與組織蛋白酶敏感連接子相比，該技術使ADC的DAR＝8制備更為容易。

β－半乳糖苷酶

最近報道了一種使用β－半乳糖苷酶裂解連接子的ADC，其中包含PEG10間隔子。間隔子被硝基取代，以提高自降解速率。類比β－葡萄糖醛酸酶連接子，其解離機制涉及水解β－半乳糖苷酶部分，它賦予化學前體親水性。另一個優(yōu)勢是β－半乳糖苷酶僅存在于溶酶體中，而β－葡萄糖醛酸酶在溶酶體中表達，也在實體瘤的微環(huán)境中表達。研究證明，在抗HER2－ADCs釋放MMAE的背景下，含β－半乳糖苷酶連接子的 ADC在體外和體內均比T－DM1更為有效。

硫酸酯酶

最近，出現(xiàn)了硫酸酯酶裂解的連接子，硫酸酯酶在幾種癌癥類型中過度表達，表現(xiàn)出潛在的選擇性。研究涉及以MMAE為有效載荷的抗Her2抗體，與經(jīng)典的可切割Val－Cit和Val－Ala連接子相比，硫酸酯酶連接子對Her2＋細胞系顯示出相似的效力。